天游线路检测中心 蛋白质 3D 结构的超快速分析
-10 分钟内创建冷冻电镜样品-

采访 15

大阪大学药学研究生院
生物结构与功能分析领域
井上刚教授

蛋白质等生物分子的三维结构已成为生物化学和药物发现研究中的重要信息。随着使用冷冻电子显微镜的分析方法变得越来越普遍，我们向开发了大大加快这一过程的工具“EG-grid™”的井上教授询问了其特点。

冷冻电镜的快速传播

冷冻电子显微镜（以下简称冷冻电镜）作为分析蛋白质三维结构的方法正在迅速流行。国际公共数据库PDB（蛋白质数据库）包含每天发现的新生物聚合物。

从图表上看，电子显微镜的数据似乎在2017年左右开始增加。事实上，这一年诺贝尔化学奖授予了三位创造了冷冻电子显微镜基础技术的欧美研究人员。 “诺贝尔奖提高了人们对冷冻电镜及其方法的认识，加速了其应用，”井上说。

冷冻电镜如此受欢迎的原因是它不需要蛋白质结晶，而蛋白质结晶以前对于 X 射线晶体学至关重要。 X 射线晶体学是了解三维结构的主要方法，但该方法分析 100
另一大优点是可以用少量样品进行分析。分析难以纯化的蛋白质和不稳定且容易聚集的复合物的结构变得更加容易。

即使使用冷冻电镜，样品制备也需要一个月

因此，冷冻电镜并不耗时。起初，准备样品和拍照需要时间。

单颗粒分析用于分析三维结构，在该方法中，使用冷冻电镜拍摄单个颗粒的许多图像。为了提高精度，准备了大量从不同角度拍摄的图像，并根据这些图像使用计算机重建三维结构。因此，准备可以有效拍摄的适当样本对于加快研究速度至关重要。

制备样品时，冰包埋法（冰包埋法）

“调整浓度很困难，但冰嵌入方法的最大问题是所谓的择优取向，这意味着蛋白质最终面向相同的方向。”（井上教授）

择优取向发生在冷冻过程中。也有冻结前面向同一方向的情况。在这种情况下，高度疏水性的蛋白质被吸附在气液界面上并最终指向相同的方向。使用传统的样品制备方法，研究这些条件可能需要近一个月的时间。

Inoue 教授和他的同事开发了一种名为 EG-grid™（环氧化石墨烯

通过使用这款EG-grid™，过去需要近一个月的生产时间已缩短至10分钟或10分钟以上。即使包括冷冻过程，现在也可以在大约 20 分钟内将其安装在冷冻电子显微镜中。

拍摄效率也提高了。与使用冰包埋法获得的样品相比，一张照片中获得的有效颗粒数量有所增加，因此所需的图像更少。根据蛋白质的不同，可以使用比以前少 1/10 或 1/20 的图像进行分析。

这项开发是由“神秘的杀菌除臭剂”引发的

EG-grid™ 的开发始于与神秘的杀菌除臭剂的邂逅。

2015年，大阪大学接到1次咨询。 “当一位口腔癌末期患者使用这种抗菌除臭剂消除异味后，癌症就消退了。您能解释一下其背后的机制吗？如果真的有效，我想用它作为抗癌药物。”就这个话题请来了咨询，还给了他“神秘之水”。当我问她成分是什么时，她说：“我不能告诉你。”

这是一个非常可疑的故事，但当我请自由基专家、工学研究生院的福住俊一教授（当时）分析它时，他很快就确定了主要成分和机制。主要成分为亚氯酸根离子（ClO₂^-)。这种ClO₂^-是一种高反应性二氧化氯 (ClO₂)的机制。

大阪大学后来决定将这种高度安全的“水”称为“按需亚氯酸根离子水溶液”（MA-T：匹配转化系统）。这是为了避免与其他产生氯气的物质混淆。

与福住教授同属一个研究小组负责分析的特聘教授大久保教授（当时）是一位光化学专家，他对“如果我们用光照射会发生什么？”产生了兴趣。当二氧化氯在酸性条件下以气体形式释放并暴露在光下时，他们注意到它被分解为活性氧和氯自由基。人们还发现，利用活性氧和氯自由基可以氧化多种物质。

例如，可以氧化甲烷来生产甲醇和甲酸。没有二氧化碳排放。这是世界上首次在常温常压条件下合成甲醇。甲烷可以从牛粪或石油和天然气钻探场地获得，但一直难以运输，但将其转化为液体甲醇或甲酸使其更容易运输，并且可以更广泛地使用。

EG-grid™ 在冷冻电镜中利用了这种氧化反应。如果石墨烯的表面被氧化以添加羟基（-OH），则有可能附着官能团以将蛋白质固定在那里。这些想法促成了 EG-grid™ 的开发。

井上教授认为新发现的氧化反应和高度安全的MA-T可以有广泛的应用，因此他向日本科学技术振兴机构（JST）产学共创平台合作研究促进计划（OPERA）提出了申请。这是为了推进实践研究。但要想入选，需要筹集相当数量的联合研究经费。期限还不到三个月。 JEOL 是当时响应这一热潮的公司之一。

该公司于2018年成立了大阪大学-JEOL YOKOGUSHI合作研究所，因此他们决定用它来资助研究。井上教授的提案被OPERA成功采纳（实施期限：2019年10月至2024年3月）。 EG-grid™ 的开发也在进行中，但 JEOL 的CRYO ARM™ 200也支持了。

这部歌剧成果丰硕，受到高度评价。 2024年2月，荣获第6届日本开放创新奖内阁总理大臣奖。甲烷氧化研究于同年4月获得文部科学大臣科学技术领域奖，其成果也被收录在日本科学会议的提案“产官学民共同应对气候危机”（将于2025年10月发布）中。

还创造了许多专利。日本 MA-T 产业协会在收到多家公司使用该专利的请求后成立（2020 年 11 月）。有91家会员公司和22家支持会员/组织（截至2025年1月）。 2025年大阪/关西博览会上，日本MA-T产业协会在大阪保健馆设立展位，展示人和宠物的口腔护理产品，以及空间喷雾/喷雾式环保护理产品。这两件展品都展示了高度安全的 MA-T 的潜力。

冷冻电镜的保护范围进一步扩大

让我们回到 EG-grid™。我们已经提到EG-grid™将样品制备时间从一个月缩短到10分钟以上，成像时间缩短到两个小时左右。最后一步是计算机分析，大约需要两到三天的时间。计算机处理现在是瓶颈。

目前，我们正在考虑 EG-grid™ 的姊妹产品，即具有其他官能团而不是环氧基团的产品。当连接酰基氯（氯化合物）时，它与蛋白质（氨基和硫醇基）的结合速度比环氧基更快。但由于处理困难，无法销往世界各地。为了响应固定 His 标签蛋白质的要求，已经生产了几种原型。然而，所有这些的问题是蛋白质都指向同一个方向。 “不过，它仍然可以用作捏击器，因为它可以从与首选方向不同的方向拍摄图像，”井上教授说。

如果你敢于寻找冷冻电镜和单粒子分析结合的弱点，那就是它不擅长处理小蛋白质。此前据说必须超过100,000Da(*)。然而，现在可以分析 50,000 至 60,000 Da 的蛋白质。使用冷冻电镜进行三维结构分析的范围正在日益扩大。

※ Da（道尔顿）：¹²C原子质量的1/12为1时的质量单位

``当 X 射线晶体学是唯一可用的方法时，井上教授经常想知道，``这种蛋白质会结晶吗？如果是这样，它什么时候形成？”（井上教授），但现在冷冻电镜是首选，因为它可以立即开始分析一定质量的蛋白质。

目前对 EG-grid™ 的需求正在上升。

产品信息

透射电子显微镜 (TEM)