天游线路检测中心 NOE/NOESY基础知识│未测量NOE的原因和对策

NOE（核奥弗豪塞效应）是一种重要的 NMR 测量技术，可以揭示分子内的空间邻近关系。本专栏我们整理了微分NOE、1D NOESY、2D NOESY等测量方法的区别、如何选择、分析关键的弛豫时间，甚至无法获得NOE时的原因和对策。在回答常见问题的同时，我们将解释有效利用 NOE 测量的要点。

什么是 NOE 测量

NOE 测量（核奥弗豪塞效应）是一种用于观察空间距离较近的原子核的测量方法。 NOE测量用于确定分子的三维结构，对于低分子量化合物，它们还用于确定异构体并确认取代基的位置。

NOE 原则

NOE 是一种由于空间相邻原子核的磁影响而导致 NMR 信号强度发生变化的现象。

考虑 NOE 时，请考虑同一分子中的两个质子，如上图所示。当这些质子靠近时，会发生偶极相互作用并观察到 ​​NOE。另一方面，当质子之间的距离较大时，不会发生偶极相互作用，因此观察不到 NOE。已知偶极相互作用与核间距离和分子迁移率密切相关，如果两个核之间的距离小于 6 Å，则可能会观察到 NOE。

NOE观察法

考虑 NOE 时，请考虑同一分子中的两个质子，如上图所示。与自旋耦合引起的分裂不同，NOE 无法在前面章节介绍的 NMR 谱（1D、2DNMR）中观察到。因此，NOE 观察需要执行以下步骤。

• 无线电波照射特定质子（激发/饱和）

• 观察其他质子信号强度的变化

• 确定此更改是否是由于 NOE 引起的

NOE 测量类型

NOE 测量主要分为三种类型：

• 差分NOE：通过获取有和没有无线电波照射的频谱差异来观察稳态NOE

• 2D NOESY：用二维频谱观察瞬态 NOE

• 1D NOESY：选择性激发质子并在一维观察瞬态 NOE

稳态NOE涉及长时间照射无线电波，使特定质子进入饱和状态，饱和状态稳定后，观察到其他质子信号强度的变化。在瞬态 NOE 中，自旋状态因短期无线电波照射而暂时改变，然后在混合时间内观察到由于 NOE 引起的变化。
由于 NOE 发生的机制不同，因此必须考虑每种方法的特点来确定每种方法的测量条件。

微分 NOE 测量

微分NOE测量是一种测量特定质子在接受无线电波照射时与未照射时之间的光谱差异，并确认附近质子的信号强度变化的方法。

如上图所示，两个质子H_I和H_SH_I和H_S空间上接近且存在偶极子相互作用。 (B) 是 H_S不照射时¹H 谱。_S受到无线电波照射而饱和，H_S信号将不再可见。此时，H_I和H_SH_I的信号会更强。这就是“NOE 带来的变化”。由于 NOE 导致的信号强度变化非常小，因此我们计算 (A) 和 (B) 之间的差异并澄清差异。在差异NOE中观察到的NOE被称为“稳态NOE”。

我将介绍使用巴豆酸乙酯进行微分NOE测量的实际示例。

我想通过微分NOE测量来确定双键的构型是顺式还是反式。照射标记为 A 的甲基的质子并观察相关的 NOE。

上图最上方，巴豆酸乙酯¹显示 H 谱。下半部分显示A的甲基的质子饱和时的差异NOE谱。该数据是用400MHz设备测量的结果，在B和C处向上观察到NOE信号。

考虑到获得的测量结果
由于当照射A的甲基的质子时在B和C中观察到NOE，因此可以得出巴豆酸乙酯具有反式构型的结论。

1D 诺西

1D NOESY 是一种选择性激发特定质子并观察该质子与空间上接近它的其他质子之间的瞬态 NOE 的方法，作为一维光谱。
此测量使用软脉冲（窄带脉冲）和磁场梯度脉冲仅激发所需的质子，并记录混合时间内 NOE 的变化。由于不需要像差分NOE那样减去光谱，因此可以获得易于分析的光谱。
1D NOESY 适用于您已决定感兴趣的质子或想要轻松检查 NOE 的情况。

我将介绍使用巴豆酸乙酯进行 1D NOESY 测量的示例。
上图中，(B)是质子A被选择性激发时的1D NOESY谱，(C)是C被选择性激发时的1D NOESY谱。
1D NOESY 消除了差值 NOE 谱中因减法而产生的残余效应，从而可以获得易于分析的谱。
查看光谱的方式与差异NOE的情况相同：当选择性激发质子信号向下表示时，我们查看其他信号如何出现。
当A被选择性激发时，在B和C处观察到正NOE。另一方面，当C被选择性激发时，仅在A中观察到正NOE。从该结果可以确定巴豆酸乙酯具有反式构型。
这样，如果存在难以确定3D结构的区域，则在选择性地激励每个区域时检查结果很重要。

2D 诺西

2D NOESY 是一种以二维光谱的形式观察分子中空间上接近的质子之间的相互作用 (NOE) 的方法。该测量记录了在暂时改变质子自旋状态后，NOE 在混合时间内（瞬态 NOE）如何变化。所得光谱显示空间接近的质子之间的对角自信号和相关信号。
2D NOESY 可以全面确认整个分子的 NOE 相关性，使其适合复杂的结构分析和整体分配的确认。

从这里开始，我将解释如何查看 2D NOESY 频谱。当您想要查看整个分子的 NOE 相关性时，2D NOESY 会发挥有利作用。如上图所示，当A和C、B和D距离很近时，就会出现这样的相关信号。
在位置 A 和 B 处沿 X 轴方向切出的切片数据（以蓝色虚线表示）分别对应于选择性激发 A 和 B 的 1D NOESY 光谱。

这是巴豆酸乙酯的 2D NOESY。
查看切片数据，来自选择性激发区域（红色）的信号向下显示，具有 NOE 相关性的信号（黑色）向上显示（正 NOE）。
查看黑色显示的相关信号，您可以看到它具有下面的 NOE 相关性。
A:B 和 C
B：A
C：A
D：E
E：D

另外，关注A、B、C的NOE相关性，与上面提到的差异NOE和1D NOESY结果类似，结果支持反式的存在。

选择 NOE 测量方法的简单指南

如上所述，可以根据目的选择NOE测量方法。我们建议从 1D NOESY 开始，它易于设置测量条件并提供干净的光谱。
-----
确定感兴趣的质子时：一维测量
当您想查看整个分子的 NOE 或不确定归属时：2D NOESY
-----

NOE测量中的重要因素：弛豫时间

NOE测量的最大问题是“未检测到NOE信号！”！ “这不是这个意思吗？
在这种情况下，首先计算待测样品的纵向弛豫时间（T₁)。
在微分NOE测量中，将激励脉冲的照射时间设置为目标样品的T₁的 5 倍或更多
另外，在1D/2D-NOESY中，混合时间为目标样本的T₁

那么为什么测量NOE时需要考虑目标样品的弛豫时间呢？
这是因为NOE是基于偶极子相互作用的弛豫现象，因此NOE与弛豫时间密切相关。

在这里，我将简要解释一下 NMR 中的弛豫。

上图是自旋数=1/2的核自旋置于静磁场中时的能级示意图。
核自旋经历塞曼分裂并在磁场的影响下呈现两种能态。低能量的稳定态称为α态，高能量的稳定态称为β态。
当照射与该能量差对应的频率的无线电波时，α态的自旋吸收无线电波的能量并被激发到β态。
当α和β态的自旋数由于无线电波照射而变得相等时，能量吸收停止，这称为饱和态。
在饱和状态下，β态的自旋释放能量并返回到α态，最终恢复到原来的热平衡状态。这个过程称为松弛。
而从激发到弛豫的一系列过程就成为我们观察到的核磁共振现象。

两个附近的核自旋之间存在相互作用，这是前面描述的弛豫的驱动力。在溶液核磁共振中，偶极相互作用是促进弛豫的主要因素之一。
因此，设置与偶极相互作用密切相关的弛豫时间参数是NOE观测成功的重要关键。

NOE测量原因及对策

我们将通过以下四点来解释 NOE 无法测量的常见原因和对策。

• 样品制备和测量条件的优化

• 改变分子迁移率

• 更改共振频率

• 更改测量方法

首先检查1是否优化，如果仍然没有观察到NOE，请尝试检查2到4。

1。样品制备和测量条件的优化

由于NOE信号非常弱，样品的浓度和纯度以及测量条件设置对结果影响很大。

• 浓度：如果浓度太高，可能会发生分子间弛豫，从而削弱NOE。

• 小心顺磁性物质的污染：溶解的氧和金属离子（Fe、Cu等）会促进弛豫，是阻碍NOE的因素。

• 设定照射时间和混合时间：T₁（纵向松弛时间），照射时间应为5次以上，混合时间应为08倍左右。

2。改变分子的迁移率

NOE 的强度也取决于分子运动。
下图显示了NOE强度和分子运动之间的关系。

这条曲线理论上是根据NOE强度和偶极子相互作用之间的关系推导出来的。

纵轴为NOE强度，横轴为观测频率ω，分子相关时间t_C
t_C是分子在溶液中旋转一次所需的时间，是表示分子迁移率的参数。
换句话说，分子越小，越_C分子短，分子越大，长度越长。

在左边，t_C是分子运动短、分子运动快的小分子区域。这里观察到正 NOE。
另一方面，右侧是t_C是分子运动缓慢的长聚合物区域。这里观察到负 NOE。
换句话说，该图表明NOE的强度根据分子运动而变化很大。

测量的问题在于存在一个 NOE 为零的区域。
观察频率ω和分子相关时间t_C的乘积的区域时为 1 时，NOE 变得非常弱或无法观察到。

因此，即使在考虑了各种测量条件、观察频率 ω 和分子相关时间 t 后，如果用您拥有的设备仍无法观察到 NOE_C可能就在这个区域。

在这样的时刻，ω 或 t_C，但是
改变ω意味着改变测量磁场，所以如果你只有一台设备，可能很难立即尝试。
因此，t_C，即t_C的因素，例如测量温度和溶剂粘度。
我们建议您首先尝试更改测量的温度。

3。改变共振频率

接下来，我们将解释改变观测频率，即改变测量磁场的情况。

上图显示了NOE强度和相关时间tC的磁场依赖性。纵轴是NOE强度，横轴是相关时间t_C，每条曲线对应90MHz至920MHz。越向左，测得的磁场曲线越高。
如果低分子化合物未观察到 NOE，则使用较高磁场的装置不一定有利。
NOE 变为零_C，我们可以看到，随着磁场的增加，信号强度为零的点移动到小分子区域（分子快速移动的区域）。
相同测量条件下，磁场越高，正NOE信号强度越弱。例如，即使分子在 600MHz 设备上具有零 NOE，在 300MHz 设备上也可能观察到正 NOE。
还有，对于分子量在1000左右的分子，无论使用什么磁场装置，NOE很有可能会落入圈出的NOE极小的区域，所以要小心。

4。改变测量方法

如果即使尝试了迄今为止介绍的方法 1 至 3 后仍未观察到 NOE，请使用称为 ROESY 的测量方法。
ROESY 是旋转坐标系中的 NOE 测量。

上图是短杆菌肽S在90度测量温度下的1D NOESY和1D ROESY谱。

短杆菌肽S的NOE在90度的测量温度下几乎为零，但通过使用ROESY，可以观察由于相关性而产生的信号。用 ROESY 观察到的 NOE 称为 ROE。
ROESY最大的优点是，如示意图所示，ROE始终为正，并且不存在变为零的区域。
在这种情况下，您可能会认为从一开始就测量 ROESY 会更好，但 ROESY 有更多需要注意的参数，并且是一种更容易产生不必要信号的测量方法。
因此，当 NOESY 不起作用时，使用 ROESY 可能会更好。

NOE 测量常见问题解答

• 差异NOE信号的形状很奇怪！ ！

  在微分NOE测量中，如果照射位置偏离峰顶，就会出现自旋耦合的影响，信号的形状会发生变化。
  差异NOE将照射位置设置为峰顶。

  

  在微分 NOE 测量中选择性照射双峰或更多多重峰时，如果照射位置偏离峰顶，信号的形状将会改变。以上两张是巴豆酸乙酯甲基质子受到照射时的差值NOE谱。在 B 和 C 中观察到正 NOE。
  如果照射位置从峰顶偏移并设置为信号 A 中心附近的 ppm，则会观察到一个大的不对称信号，看起来像残留信号，如顶部光谱中虚线包围的区域所示。
  这是由于与质子 B 的自旋耦合相互作用所致。
  对于微分 NOE 测量，请务必选择峰顶作为照射位置。
  

• 为什么低分子却有负NOE？

  这是一种称为间接 NOE（三自旋效应）的现象，当质子之间具有特殊的位置关系时，有时会在低分子化合物中观察到这种现象。

  

  在溶液中快速移动的低分子化合物通常会观察到正 NOE。然而，可以在与负 NOE 相同的方向上观察到信号。
  例如，假设上图（左）所示的空间排列中有三个质子。换句话说，A和B以及B和C在空间上彼此接近，但A和C相距较远。
  上图（右）是A被选择性激发时的一维NOESY谱。由于 A 和 B 彼此靠近，因此 B 观察到正 NOE。然而，在这种情况下，在 C 中可能会观察到通过 B 的间接 NOE。间接 NOE 出现的方向与 m 正 NOE 相反。
  此信号并不表示 A 和 C 接近，所以要小心。
  当三个质子排列成近乎直线时最有可能发生这种现象，也称为“三自旋效应”。

• 为什么距离很近却没有NOE？

  当三个质子采取特殊的空间排列时，即使它们很接近，也可能观察不到NOE。

  

  3 我们将把三角问题作为自旋效应的一个特例来解释。
  如上图所示，当三个质子呈三角形空间排列时可能会发生这种情况。

  

  如果A被选择性激发，不仅A和B而且A和C也很接近，所以A和C上也应该看到正NOE，所以预期的光谱将在上图的右侧。

  

  然而，在某些情况下，从A到C的正NOE（以橙色显示）和经由B的间接NOE（以绿色显示）相互抵消，并且像这样观察不到NOE。
  理论上，当每个质子之间的距离之比变为1:1:126时，它变为零。
  换句话说，即使 NOE 在空间上很接近，也可能无法观察到。

参考文献

DW Timothy Claridge，由 Takahito Takeuchi 和 Miki Nishikawa 翻译，“有机化学的高分辨率 NMR 技术”，讲谈社科学，2004 年。

Eri Fukushi 和 Hajime Somiya，“你能理解的二维核磁共振”，化学同人，2007 年。

相关应用

使用 HSQC-NOESY 进行 NOE 观察

联系我们

如果您对使用 NOE 进行研究或有关 NMR 设备的详细信息感兴趣，请联系 JEOL。我们将通过丰富的应用示例和技术支持为您的研究提供强有力的支持。

目录下载

产品信息