ty8天游线路检测中心气相色谱飞行时间质谱 (GC-TOFMS) 对清酒中的代谢物进行非靶向分析

简介

¹⁾清酒中的氨基酸、有机酸和糖等成分被认为源自清酒中微生物（麦芽、酵母）的代谢，因此有可能通过代谢组分析对这些类型的清酒进行分类。
²⁾此外，一种综合结构分析方法，结合了ty8天游线路检测中心深度学习的质谱预测³⁾(hereinafter referred to as AI structure analysis), it is possible to estimate the structural formula Therefore, in this MSTips, we will introduce an example of non-targeted analysis of metabolites in sake using gas chromatograph time-of-flight mass spectrometry (GC-TOFMS)

实验

衍生化过程

对于样品，ty8天游线路检测中心了四种不同分类的市售清酒（大吟酿、纯米、本酿酒和黑酒）。将 Nigori 清酒离心（4°C，10 分钟，12,000 rpm），仅将上清液用于实验。我们还准备了质量检查 (QC) 样品，其中所有样品等量混合。图1显示了样品衍生化工艺流程。向各样品 20 µL 中加入 10 µL 1 mg/mL 芥子酸甲醇溶液作为内标并混合，在蒸发器中干燥，然后在干燥器中放置过夜。第二天，将 100 µL 20 mg/mL 盐酸甲氧胺吡啶溶液添加到每个样品容器中，并将样品在恒温摇床中加热并摇动（30°C，90 分钟，1200 rpm）。之后，添加50μL N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)，并将混合物在热振荡器中再次加热并摇动(37℃，30分钟，1200rpm)。

GC-MS 测量

测定中使用气相色谱飞行时间质谱仪JMS-T2000GC AccuTOF TM GC-Alpha(天游线路检测中心株式会社制造)。离子源使用EI/FI/FD共用离子源，软电离方法使用EI法和场电离(FI)法。对于每个样品，使用 EI 方法进行 n=3 次测量，使用 FI 方法进行 n=1 次测量。其他详细条件如表1所示。

图1衍生化流程

数据分析

使用 JMS-T2000GC 的控制软件 msAxel 将测量中获得的 EI 方法数据转换为 netCDF（GC-MS 的通用数据格式）。该数据应用于代谢组学分析程序 MS-DIAL（版本 49，RIKEN）进行峰检测和化合物鉴定。在鉴定化合物时，我们使用了msFineAnalysis AI（天游线路检测中心制造），它可以整合和分析EI和FI方法的数据，以更高的准确度识别峰并防止错误识别。化合物鉴定后，使用内标物质和LOWESS法进行峰归一化，导出各成分的峰高。然后是MetaboAnalyst 60⁴⁾在多变量分析过程中，ty8天游线路检测中心 AutoScaling 进行归一化后，进行主成分分析和层次聚类分析。

表1 GC-MS测量条件

结果与讨论

TICC 比较结果

图2为本次采集数据的EI法TICC。 Many components unique to sake were detected in each sample, including sugar alcohols such as glycerol and glyceryl glucoside, glucose, amino acids, and organic acids由于各样品中各成分的峰强度不同，因此ty8天游线路检测中心多变量分析进行详细分析。

＊：外部m/z校准剂

图2 清酒中代谢物的TICC

主成分分析

图 3 显示了ty8天游线路检测中心 MetaboAnalyst 对ty8天游线路检测中心内标和 LOWESS 方法标准化的数据进行主成分分析 (PCA) 的结果。从图 3-A 中的得分图中，我们能够根据第一主成分 (PC1) 的正分和负分对大吟酿清酒、本酿造清酒、Nigori 清酒和纯米清酒进行分类。据推测，这表明了清酒生产过程中是否添加酿造酒精的差异。此外，还可以根据第二主成分（PC2）的正分和负分对大吟酿清酒、本酿造清酒、浊清酒和纯米清酒进行分类。推测这是由于用作原料的大米的碾磨率不同造成的。虽然黑酒没有指定具体名称清酒的分类，但该结果表明它与本酿造酒附近绘制，因此认为两者具有相似的特征。

图3 主成分分析结果
(A) 得分图，(B) 加载图

层次聚类分析

图 4 显示了层次聚类分析 (HCA) 结果的热图。热图按颜色显示每种成分的丰度（红色：高，蓝色：低），使每个样品的成分特征可视化成为可能。作为示例，图5显示了每个样品的脯氨酸和缬氨酸的峰强度比较结果，这是君麦树的特征。脯氨酸和缬氨酸都属于氨基酸，被认为是日本酒特有的苦味成分。⁵⁾由于纯米酒仅ty8天游线路检测中心大米、曲子和水制成，不添加酿造酒精，因此一般认为其具有凸显大米鲜味和浓郁的风味。上述成分可能与本次测定的纯麦酒独特的口味有关。

图 4 层次聚类分析 (HCA) 结果

图5 峰强度比较结果
(A) 脯氨酸，(B) 缬氨酸

未在库 DB 中注册的化合物的定性分析

Among the components detected this time, there were also components that are considered to have not been registered in the library DB As an example, the integrated analysis and structure estimation results for one component (the peak at RT 1782 min in Figure 2) are described below图 6 显示了本酿造清酒中该成分的质谱图。该成分仅在FI法的质谱中被推测为分子离子，该法是软电离法m/z947，EI法未检测到相应的离子。对FI法检测到的分子离子的元素组成进行推定，该成分的分子式为C₃₇H₈₉否₁₁硅₈尽管推测该分子式源自具有还原性的二糖的肟和TMS衍生化，但保留指数值为Δ169，与具有匹配分子式且在文库检索中首次命中的化合物（β-龙胆二糖、八（三甲基硅基）醚、甲基肟（异构体1））显着不同（表2）。因此，该组分的分子式为C₃₇H₈₉否₁₁硅₈，但实际上估计是库DB中未注册的组件。图7显示了该组件的AI结构分析结果。第一个候选物是二糖的异麦芽酮糖衍生物。由于异麦芽酮糖衍生物尚未在 NIST 库中注册，因此该成分有可能是异麦芽酮糖。
Even for high-mass components that are difficult to analyze using metabolomics analysis using the EI method, we were able to clearly detect molecular ions using the FI method此外，即使未在库DB中注册，也可以推断结构式。

图6 未知化合物的质谱

表2 未知化合物综合定性分析结果

图7 未知化合物AI结构分析结果

结论

在此 MSTips 中，我们介绍了ty8天游线路检测中心 GC-TOFMS 对日本清酒中的代谢物进行非靶向分析的示例。即使是ty8天游线路检测中心传统 GC-MS 测量难以测量的高极性代谢物也可以通过 TMS 衍生化轻松测量。此外，通过进行多变量分析，我们能够按类型对清酒进行分类。此外，即使对于由于分子量大而难以通过GC-QMS测量的二糖的TMS衍生物，我们也能够ty8天游线路检测中心GC-TOFMS和FI方法测量分子离子。即使对于尚未在库中注册的化合物，也可以ty8天游线路检测中心未知物质结构分析软件msFineAnalysis AI来估计其结构式。已证实 GC-TOFMS 和 msFineAnalysis AI 在ty8天游线路检测中心 GC-MS 的代谢组学领域是有效的。

参考文献

• 国家税务局。 2023“清酒制造方法质量显示标准”概述。.
• M。 Ubukata 等人，Rapid Commun Mass Spectrom。 2020； 34：e8820。
• 代谢分析器 60。
• 小川春夫。日本清酒的成分和风味。气味和气味环境学会杂志，卷。 46，第 5 期，2015 年。

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