天游线路检测中心 使用气相色谱飞行时间质谱 (GC-TOFMS) 对清酒中的代谢物进行非靶向分析

简介

清酒是一种传统的日本清酒，其主要成分是大米、米曲和水。除酒精外，清酒还含有氨基酸、有机酸和糖等成分，这些成分会产生各种风味和味道。此外，根据大米的抛光率和是否添加酿造酒精，清酒分为特定清酒类型（吟酿清酒、纯米清酒、本酿造清酒）和普通清酒等其他类型。¹⁾清酒中的氨基酸、有机酸和糖等成分被认为源自清酒中微生物（麦芽、酵母）的代谢，因此有可能通过代谢组分析对这些类型的清酒进行分类。
气相色谱-质谱仪 (GC-MS) 因其丰富的文库数据库 (DB)、易于操作和测量重复性高而被广泛用于代谢组分析。尽管GC-MS针对的是高挥发性成分，但通过进行TMS转换等衍生化处理，也可以测量高极性水溶性代谢物，例如糖和氨基酸。另外，在代谢组学领域，可能会检测到未在库DB中注册的“未知物质”。在这种情况下，通过使用飞行时间质量计（TOFMS）作为质谱仪并进行结合了电子电离和软电离方法的“综合分析”，甚至可以确定未知物质的分子式。²⁾此外，一种综合结构分析方法，结合了使用深度学习的质谱预测³⁾配备的“未知物质自动结构分析软件msFineAnalysis AI”（以下称为AI结构分析），可以推定结构式。因此，在本 MSTips 中，我们将介绍一个使用气相色谱飞行时间质谱 (GC-TOFMS) 对清酒中代谢物进行非靶向分析的示例。

实验

衍生化过程

对于样品，我们使用了四种不同类别的市售清酒（大吟酿清酒、纯米清酒、本酿造清酒和黑酒）。将 Nigori 清酒离心（4°C，10 分钟，12,000 rpm），仅将上清液用于实验。我们还准备了质量检查 (QC) 样品，其中所有样品等量混合。图1显示了样品衍生化工艺流程。向各样品 20 µL 中添加 10 µL 1 mg/mL 芥子酸甲醇溶液作为内标，混合后，在蒸发器中干燥，然后在干燥器中放置过夜。第二天，将 100 µL 20 mg/mL 盐酸甲氧胺吡啶溶液添加到每个样品容器中，并将样品在恒温摇床中加热并摇动（30°C，90 分钟，1200 rpm）。之后，添加50μL N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)，并将混合物在热振荡器中再次加热并摇动(37℃，30分钟，1200rpm)。

GC-MS 测量

测定中使用气相色谱飞行时间质谱仪JMS-T2000GC AccuTOF TM GC-Alpha(日本电子株式会社制造)。离子源使用EI/FI/FD共用离子源，软电离方法使用EI法和场电离(FI)法。对于每个样品，使用 EI 方法进行 n=3 次测量，使用 FI 方法进行 n=1 次测量。其他详细条件如表1所示。

图1衍生化流程

数据分析

使用 JMS-T2000GC 的控制软件 msAxel 将测量中获得的 EI 方法数据转换为 netCDF（GC-MS 的通用数据格式）。该数据应用于代谢组学分析程序 MS-DIAL（版本 49，RIKEN）进行峰检测和化合物鉴定。在鉴定化合物时，我们使用了msFineAnalysis AI（天游线路检测中心制造），它可以整合和分析EI和FI方法的数据，以更高的准确度识别峰并防止错误识别。化合物鉴定后，使用内标物质和LOWESS法进行峰归一化，导出各成分的峰高。然后是MetaboAnalyst 60⁴⁾在多变量分析过程中，使用 AutoScaling 进行归一化后，进行主成分分析和层次聚类分析。

表1 GC-MS测量条件

结果与讨论

TICC 比较结果

图2为本次采集数据的EI法TICC。每个样品中都检测到了许多清酒特有的成分，包括甘油和甘油葡萄糖苷等糖醇、葡萄糖、氨基酸和有机酸。由于各样品中各成分的峰强度不同，因此使用多变量分析进行详细分析。

＊：外部m/z校准剂

图 2 清酒中代谢物的 TICC

主成分分析

图 3 显示了使用 MetaboAnalyst 对使用内标和 LOWESS 方法标准化的数据进行主成分分析 (PCA) 的结果。从图 3-A 中的得分图中，可以根据第一主成分 (PC1) 的正分和负分对大吟酿清酒、本酿造清酒、Nigori 清酒和纯米清酒进行分类。据推测，这表明了清酒生产过程中是否添加酿造酒精的差异。此外，还可以根据第二主成分（PC2）的正分和负分对大吟酿清酒、本酿造清酒、浊清酒和纯米清酒进行分类。推测这是由于用作原料的大米的碾磨率不同造成的。虽然黑酒没有指定具体名称清酒的分类，但该结果表明它与本酿造酒附近绘制，因此认为两者具有相似的特征。

图3 主成分分析结果
(A) 得分图，(B) 加载图

层次聚类分析

⁵⁾由于纯米酒仅使用大米、曲子和水制成，不添加酿造酒精，因此一般认为其具有凸显大米鲜味和浓郁的风味。上述成分可能与本次测定的纯麦酒独特的口味有关。

图 4 层次聚类分析 (HCA) 结果

图5 峰强度比较结果
(A) 脯氨酸，(B) 缬氨酸

未在库 DB 中注册的化合物的定性分析

在这次检测到的组件中，还检测到了一些被认为尚未在库DB中注册的组件。作为示例，下面描述了一种组分的综合分析和结构估计结果（图 2 中 RT 1782 分钟处的峰值）。图 6 显示了本酿造清酒中该成分的质谱图。该成分仅在FI法的质谱中被推测为分子离子，该法是软电离法m/z947，EI法未检测到相应的离子。通过FI法对检测到的分子离子的元素组成进行推定，该成分的分子式为C₃₇H₈₉否₁₁硅₈尽管推测该分子式源自具有还原性的二糖的肟和TMS衍生化，但保留指数值为Δ169，与具有匹配分子式且在文库检索中首次命中的化合物（β-龙胆二糖、八（三甲基硅基）醚、甲基肟（异构体1））显着不同（表2）。因此，该组分的分子式为C₃₇H₈₉否₁₁硅₈，但实际上估计是库DB中未注册的组件。图7显示了该组件的AI结构分析结果。第一个候选物是二糖的异麦芽酮糖衍生物。由于异麦芽酮糖衍生物尚未在 NIST 库中注册，因此该成分有可能是异麦芽酮糖。
即使对于使用 EI 方法的代谢组学分析难以分析的高质量组分，我们也能够使用 FI 方法清晰地检测分子离子。此外，即使未在库DB中注册，也可以推断结构式。

图6 未知化合物的质谱

表2 未知化合物综合定性分析结果

图7 未知化合物AI结构分析结果

结论

在此 MSTips 中，我们介绍了使用 GC-TOFMS 对日本清酒中代谢物进行非靶向分析的示例。即使是使用传统 GC-MS 测量难以测量的高极性代谢物也可以通过 TMS 衍生化轻松测量。此外，通过进行多变量分析，我们能够按类型对清酒进行分类。此外，即使对于由于分子量大而难以通过GC-QMS测量的二糖的TMS衍生物，我们也能够使用GC-TOFMS和FI方法测量分子离子。即使对于未在库中注册的化合物，也可以使用未知物质结构分析软件msFineAnalysis AI来估计其结构式。已证实 GC-TOFMS 和 msFineAnalysis AI 在使用 GC-MS 的代谢组学领域是有效的。

参考文献

• 国家税务局。 2023“清酒制造方法质量显示标准”概述。https://wwwntagojp/taxes/sake/hyoji/seishu/gaiyo/02htm.
• M。 Ubukata 等人，Rapid Commun Mass Spectrom。 2020； 34：e8820。
• A kubo 等人，质谱，2023, 12, A0120。
• 代谢分析器 60。https://metaboanalystca/
• 小川春夫。日本清酒的成分和风味。气味和气味环境学会杂志，卷。 46，第 5 期，2015 年。

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