天游线路检测中心 使用阵列断层扫描对生物样品进行三维观察
SM067
简介
阵列断层扫描是一种通过固定和树脂包埋的生物样品制备连续超薄切片，使用透射电子显微镜 (TEM) 或扫描电子显微镜 (SEM) 观察每个切片上的相同位置并堆叠连续断层扫描图像来进行三维观察的方法。在这里，我们介绍使用SEM的方法和数据。
使用SEM的阵列断层扫描方法的特点
- SEM 和背散射电子探测器性能的改进使图像质量接近 TEM 图像。
- 可以使用软件进行自动观察。
- 可以加载和观察大样本。
- SEM 的连续切片可以放置在硅片或载玻片等硬质基底上，因此制备 TEM 的连续切片相对更容易。
- 由于截面的大小或数量没有限制，因此可以在 XYZ 方向上的大范围内进行三维观察。
- 唯一需要的设备是超薄切片机和 SEM；不需要特殊设备。
- 通过醋酸双氧铀或柠檬酸铅后染色可以增加连续切片的对比度，因此不需要NCMIR法等特殊的样品固定方法，样品可以使用普通的双固定环氧块。
- 观察后样本保持完整，可以重新观察。
使用阵列断层扫描方法的三维重建流程
组织和细胞的三维重建可以通过观察、对齐和堆叠来自固定用于常规 TEM 观察的环氧树脂包埋样品的连续切片来进行。我已经说明了一般步骤。
程序
- ①样品（环氧块）
- ② 修剪
- ③连续超薄切片的制备（超薄切片机）
- ④ 船上恢复
- ⑤ 使用 SEM 连续观察和摄影
- ⑥ 调整拍摄数据
- ⑦通过堆叠进行三维重建
- ⑧ 细分
- ⑨ 三维重建图像的显示与分析
小脑分子层三维重建
| 示例 | 小鼠小脑 |
| 固定方法 | 戊二醛和四氧化锇双重固定 |
| 后染色 | 乙酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色 |
| 拍摄图像尺寸 | 5,120 × 3,840 像素 |
| 像素大小 | 6 纳米 |
| 截面厚度 | 45 纳米 |
| 拍摄次数 | 97 张照片 |
| 三维重建范围 | 123 x 123 x 45 μm（2k x 2k x 97 像素） |
| 对准软件 | 斐济（免费软件）https://fijisc） |
| 三维重建软件 | 堆垛机（SIF制造） |
| 分割软件 | 调色师（由 SIF 制造） |
从三维重建范围中选择两个树突、六个轴突、一个突触和一个神经胶质细胞并进行分割。
轴突、树突和神经胶质
利用阵列断层扫描方法三维重建生物样本①~小鼠小脑分子层神经组织~
有限元扫描电镜(JSM-7900F，JEOL制造)，利用阵列断层摄影法对小脑的神经组织的一部分进行三维重建。三维重建是通过堆叠小脑组织的连续切片来进行的，并对感兴趣的细胞和结构进行分割。
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树突轴突突触
利用阵列断层扫描方法对生物样本进行三维重建②~小鼠小脑，分子层突触周围~
使用FE-SEM（JSM-7900F，JEOL制造）的背散射电子图像（BEI），我们使用阵列断层扫描对小脑分子层中浦肯野细胞树突和轴突之间的突触周围区域进行了三维重建。三维重建是通过堆叠连续切片来分割感兴趣的细胞和结构来执行的。
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