天游线路检测中心 使用通用 TEM 的冷冻电子显微镜 - 从冰包埋样品制备到冷冻观察 -

简介

透射电子显微镜（TEM）是一种利用电子透镜放大穿过薄膜样品的电子以获得透射图像的设备。使用 TEM 观察生物样品时必须采取以下预防措施。首先是样品必须放置在真空中，无法在活体状态下对其进行观察，其次是样品的结构可能会因电子束照射而发生变化。
冷冻 TEM 法是一种将样品冷冻并保持在冷冻状态以进行 TEM 观察的方法。特别是对于分散在水等液体中的颗粒样品，由于我们观察的是样品与其溶液一起冻结的冰包埋样品，1）可以观察液体中样品的结构，并且可以捕获接近生命状态的结构，2）样品被周围的冰冷却，从而可以减少样品被电子束照射产生的热量破坏的可能性。使用通用 TEM 进行冷冻观察可以使用冷冻转移支架进行，但在处理支架和操作 TEM 时需要记住一些要点。本文介绍了从样品制备到图像观察的一系列步骤。

冷冻观察需要准备的东西

1。亲水化处理设备

进行网格亲水化处理。

2。自动浸没式冷冻装置

准备冰包埋样品。

3。网格

拉伸穿孔碳膜
使用网格。

4。液氮

冷却标本和工具，以及
用于液化乙烷气体。

5。乙烷气

冷冻样品时用作制冷剂。

6。网格框

将网格保存在液氮中。

7。冷冻转移支架

将冰包埋样品运送至 TEM 并观察。

8。泵站

对支架进行抽真空。

冰包埋样品制备

病毒和生物蛋白等颗粒样品的冰包埋样品（图 1）需要 (1) 足够厚以传输电子束（几十到数百纳米），(2) 冰必须是无定形的。为了实现这两点，我们使用自动浸入式冷冻装置（Leica EMGP）制备了冰包埋样品（图2），我们将解释所涉及的一系列步骤。

~程序~

1. 使用亲水处理装置对网格进行亲水处理。
2. 准备自动浸入式冷冻机 (EMGP)。
   ➀打开主电源，等待箱内温度和湿度达到设定温度和湿度。
   ② 将液氮倒入液氮罐中，等待乙烷容器冷却至-180℃以下。
   ③将乙烷气体倒入乙烷容器中并使其液化。
   ④ 用镊子夹住带有穿孔支撑膜的亲水处理网格。
   ⑤ 将夹住网格的镊子放入腔室中。
3. 用微量移液器量取几μl样品分散液，滴在网格上（图2（a））。
4. 用滤纸吸去多余的样品溶液（图2(b)）。
   *这样做是为了调整冷冻后样品的厚度。
5. 将镊子从腔室中放入乙烷容器中的液体乙烷中，以快速冷冻样品（图2（c））。
   *快速冷冻将样品嵌入无定形冰中。
6. 将冷冻网格从乙烷容器转移到液氮中的网格盒中，并将它们储存在液氮气氛下。

图。 1 冰包埋样品

图。 2 EMGP结构及冰包埋样品制备方法

样品运输

冰包埋样品必须冷冻在支架中并运输到 TEM。
使用的冷冻转移支架是 Gatan 698 型（图 3）。这显示了样品运输和 TEM 观察的顺序。

~程序~

1. 准备低温转移支架。
   ➀ 在泵站抽真空几个小时。
   *通过对杜瓦瓶进行抽真空，冷却状态可维持约8小时。
   ② 将支架安装在工作站和温度控制器上。
   ③ 将液氮倒入杜瓦瓶和工作站中，并将支架尖端冷却至-180°C 以下。
   *您可以使用温度控制器检查支架尖端的温度。
2. 将网格盒从 EMGP 乙烷容器转移到工作站。
3. 从网格盒中取出网格并将其置于氮气气氛下的网格装载部分中。
4. 用百叶窗盖住网格加载部分，然后将支架插入 TEM。
   *关闭可减少电网上的霜冻积聚。

图。 3 冷冻转移支架的结构

冷冻观察

为了观察冰嵌入的样品，需要减少电子束对样品的损伤，以防止冰融化。
MDS（最小剂量系统）是一种执行从寻找视野、聚焦到使用低电子剂量拍摄等一系列步骤的系统。
以下显示了将低温转移支架插入 TEM 后使用 MDS 进行低温观察的流程。

~程序~

1. 在极低的放大倍数下检查样品的状况。
   *如果冰太厚而无法确认样品，或者如果滤纸吸收了太多液体并且支撑膜的孔中不存在冷冻样品，请考虑样品制备条件并重试。
2. 确定成像放大倍数（通常：约x10k至x100k）和对样品施加的电子束照射量（通常：约20-40 e-/Å2），然后相应地设置每种MDS模式的放大倍数以及每种模式要使用的视场（图4）。

   ➀搜索模式…	搜索视野的模式。 由于使用低倍率，几乎没有样品损坏。
   ②对焦模式…	对焦模式。 调整拍摄位置附近支撑膜上的焦点。
   ③照片模式…	拍摄模式。 设置成像期间的放大倍率和电子束照射量。

3. 使用配置的 MDS 的三种模式：搜索、聚焦和照片进行观察和拍照。
   *请注意，正焦点处几乎没有对比度，因此在照片模式下，散焦会应用数百纳米到几微米。

图。 4 各MDS模式下的电子束照射范围

冷冻观察数据

图5(a)和5(b)显示通过使用上述程序制备冰包埋样品、运输样品并进行冷冻观察而获得的TEM图像。
图。图5(a)是使用透射电子显微镜JEM-1400Flash以120kV加速电压获得的脂质体的冷冻图像。我们能够捕获负染色难以捕获的多层结构。
图。图5(b)是使用加速电压为200kV的透射电子显微镜JEM-F200获得的蛋白质(脱铁铁蛋白)的冷冻图像。我们能够获得分散的脱铁铁蛋白颗粒的图像。
图。图5(c)显示了通过对使用自动成像软件JADAS获取的2,800张TEM图像中拾取的175,499个颗粒进行单颗粒分析而确定的脱铁铁蛋白的三维结构。这样，利用自动成像软件，也可以通过单粒子分析获得三维结构。

图。 5 使用通用TEM获得的冷冻观察数据