天游线路检测中心 使用 JEM-1400Flash 观察生物样品 - 从样品制备到观察的流程 -

简介

电子显微镜可以让您观察光学显微镜无法看到的细胞内的微小结构。电子显微镜对于捕获线粒体和叶绿体等细胞器的详细结构至关重要。然而，使用TEM，无法在活体状态下观察样本，因为它是在真空中观察的，并且必须将样本切成薄片以让电子束穿过它。因此，为了清楚地捕获接近其活体状态的目标结构，样品制备是极其重要的要素。
在这里，我们将展示使用植物组织观察生物样本的过程的示例，并介绍使用JEM-1400Flash获得的数据。

样品制备流程

制备生物样品的方法有很多种，但这里我们将以化学固定的样品固定和使用超薄切片机的超薄切片为例进行介绍。样品制备如下：1将样品切成小片→2固定→3脱水→4更换→5包埋→6聚合→7修整→8超薄切片的制备→9染色等过程完成。下面解释每个过程。

1。样品切割

使用剃刀将样品切成小块，以便进一步处理中使用的化学品更容易渗透。

2。已修复

这是一个旨在阻止生物样本结构变化并将其保存在接近生命状态的过程。对于化学固定，固定进行两次：预固定和后固定。固定前固定蛋白质，固定后固定脂质。
*四氧化锇具有高度挥发性和反应性，会损害使用者的呼吸系统、皮肤和粘膜，因此请在通风橱中工作。

需要准备的东西

• 预固定剂：01M HEPES 中的 25% 戊二醛 + 2% 多聚甲醛^*1(半卡诺夫斯基)
• 后固定剂：1% 四氧化锇溶液（01M HEPES 中的 OsO₄）
• 清洁溶液：01 M HEPES 或蒸馏水
• 样品瓶

^*1HEPES：缓冲溶液2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸的缩写

3。脱水

使用乙醇或丙酮对细胞中的水进行脱水。如果有任何水分残留，将会干扰后续树脂嵌入过程中的树脂聚合。如下将样品浸入各浓度的乙醇中，用乙醇代替样品中的水。

4。替换

用乙醇脱水时，使用环氧丙烷(PO)作为中间剂进行取代，使其与环氧树脂相容。

^*2EPON 812：树脂，^*3DDSA·^*4MNA：固化剂，^*5DMP-30：加速器

5。嵌入

为了制作超薄切片，需要将样品包埋在树脂等硬质包埋介质中。随后的聚合使液体树脂硬化。

需要准备的东西

• 环氧树脂
• 硅嵌板（图1）

• 将样品朝向硅包埋板的尖端放置
• 倒入树脂
• 稍微搅拌一下

图1硅嵌入板

6。聚合

对树脂施加热量使其硬化并允许其切片。将硅胶包埋板放入烤箱中，在 60°C 下加热 3 天。
通过稳定聚合过程中的温度来防止树脂聚合不良。

需要准备的东西

• 树脂聚合烘箱

7。修剪

移除周围区域并调整待观察表面的形状，使待观察区域足够大，可以放置在样品网格上。

需要准备的东西

• 剃须刀
• 体视显微镜

8。超薄切片的制备

用玻璃刀刨平表面，用金刚石刀切薄至电子束可以通过的厚度，放在网格上。

需要准备的东西

• 超薄切片机
• 网格
• 钻石刀
• 玻璃刀

• 睫毛探针（图2）
• 亲水化处理设备

图 2 睫毛探针

9。染色

执行此操作是为了增加含有许多轻元素的生物样本的对比度。通过将重元素与样品结合来增加散射对比度。当对放置在网格上的薄片进行染色时，使用乙酸双氧铀和柠檬酸铅作为染色剂进行双重染色。
醋酸双氧铀对核质和核糖体进行染色，柠檬酸铅对细胞膜、糖原颗粒、核糖体等进行染色。

需要准备的东西

• 乙酸双氧铀^*6
• 柠檬酸铅

^*6乙酸双氧铀是一种国际管制物质，只能在获得使用许可的设施中使用。
乙酸镱是乙酸铀酰的替代溶液。

结果

图3显示了使用TEM (JEM-1400Flash)观察使用上述过程制备的超薄切片样品的结果。

图 3 TEM 图像
这是对枫叶的观察。可以清晰地捕捉到细胞器的膜结构。
在图 3 左侧的图像中，您可以看到中间的高尔基体和两侧的叶绿体。
您可以从图 3 右侧的图像中看到线粒体膜的结构。