天游线路检测中心 推出下一代 200 kV 冷冻 TEM

简介

图。 1

新型冷冻 TEM“CRYO ARM™”的外部视图

冷冻 TEM 方法是一种可以快速冷冻纯化蛋白质、病毒和细胞等样品的方法，可以在观察它们的同时保留其在溶液中的分子形式。近年来，冷冻透射电镜方法因其与单粒子分析、电子断层扫描等三维重建方法的结合而受到关注[1]。其背景是随着电子束直接曝光探测器的出现，采集图像的分辨率不断提高，并且由于 TEM 自动化功能的扩展，吞吐量也随之增加。特别是单颗粒分析方法的发展令人瞩目，近原子分辨率等高分辨率的蛋白质结构分析结果相继被报道，分析结果有望为药物发现领域做出贡献[2]。

JEOL 开发了冷冻 TEM，它具有高通量和可操作性，并且可以进行更高分辨率的结构分析。该设备是基于JEM-ARM200F开发的，被昵称为“CRYO ARM™”（图1）。电子枪为场发射电子枪(FEG)，加速电压为200 kV。其他功能包括专用冷冻台、自动多样品传输机构、自动液氮填充机构、自动图像采集软件、欧米茄滤光片和相位板。我们现在将更详细地讨论每个功能。

电子枪

首先，关于电子枪，该设备允许您在冷阴极场发射型（CFEG）或肖特基型（TFEG）之间进行选择。
CFEG发射电子的能量宽度约为TFEG的50%（图2），光源尺寸约为10 nm，约为TFEG的十分之一，因此相干性高，可以获得色差影响较小的图像。因此，在主要观察相衬的低温TEM中，可以预期图像对比度的提高，并且可以提高以低电子照射密度获得的图像的分辨率。使用每个电子枪实际上观察了铂铱的标准样品。当应用-1000 nm的高散焦时，如在冷冻TEM观察中，用CFEG可以观察到更精细的晶格条纹（图3）。当对每个图像进行傅里叶变换时，用TFEG观察到019 nm的峰值，而用CFEG观察到014 nm的峰值（图3）。

图。 2

每个电子枪的能量分辨率。使用冷场发射（蓝色）和肖特基（红色）电子枪获得的零损耗光谱，半宽度分别为 04 eV 和 08 eV。

Fig 3

使用冷场发射 (A) 和肖特基 (B) 电子枪观察铂铱。每个-1μm 的情况下获取的。右上角的插图是每幅图像的傅里叶变换图像。

低温台和低温极片

该设备配备了液氮冷却的专用低温台，可以在100 K或更低的极低温度下进行样品观察，并且还设计了减少冰污染的设计，可以进行长期观察。此外，位于该平台上的极片可以选择高分辨率型或高倾角型。对于高分辨率型，每个极片的保证分辨率为粒子图像025 nm，点阵图像02 nm，高倾斜型粒子图像030 nm，点阵图像02 nm。高分辨率型的每个极片的倾斜角度为±10°，高倾斜型的每个极片的倾斜角度为±70°。如果选择高倾斜类型，则可以进行双轴倾斜断层扫描，因为样品可以在平面（0°⇔90°）内旋转。

CryoSPECPORTER™

上述冷冻台配备了多样本自动传输机制（CryoSPECPORTER™），可实现自动样本交换。 CryoSPECPORTER™ 最多可容纳 12 个专用样品盒，并可自动将任何样品运输至冷冻台（图 4）。准备好的样品网格可以加载到专用冷冻工作站的液氮环境中的盒中（图4A）。此外，使用专用转移杯将试剂盒转移至 CryoSPECPORTER™（图 4A）。一次最多可以运输四个样本，并且可以从GUI加载和卸载任意样本，因此该设备也可以用于样本筛选。由于CryoSPECPORTER™部件也使用液氮冷却，因此样品可以在105 K以下的温度下长期保存。此外，镜体和CryoSPECPORTER™部件通过涡轮分子泵抽真空，电子枪部件通过溅射离子泵抽真空，形成无油且清洁的排气系统。

图。 4

将冷冻样品运输至“CRYO ARM™”。 (A) 在冷冻工作站中，将冷冻样品装入卡盒中，并在液氮温度下将卡盒装入盒中。使用冷冻转移杯（蓝色框架）将装有样品盒的储存盒运输至“CryoSPECPORTER™”。后续操作可通过侧面的触摸屏（红框）进行。 (B)“CryoSPECPORTER™”的概念图。由冷冻传送杯传送的弹匣通过弹匣拾取杆传送到“CryoSPECPORTER™”中。使用样品交换杆将装有每个样品的盒从料盒装载到样品存储器中。之后，用户指定的试剂盒通过样品交换杆传送至冷冻台。

各种机能

此外，该装置还配备了自动液氮填充机构、自动平行照射功能、自动图像采集软件（JEOL自动数据采集系统：JADAS）等各种自动化功能，显着提高了吞吐量。液氮自动填充机构可在任何剩余氮气水平和时间自动从外部连接的液氮罐向低温台和 CryoSPECPORTER™ 填充液氮。使用100L液氮罐时，可自动供给一周左右。
JADAS 是专为单颗粒分析而开发的自动图像采集软件。基本操作通过五个按钮进行（图5A），因此即使是新手也可以使用它。此外，可以从 GUI 执行 TEM 对准操作（图 5A）。成像的基本过程是首先在低倍率模式下捕获样品网格的整个图像。从那里检测网格。此后，它移动到每个检测到的网格，获得低倍图像（搜索图像），并检测支撑膜上的孔。接下来，在支撑膜上执行自动聚焦后，在每个孔处获取用于单颗粒分析的图像。该软件提供了多种成像方法的配方，因此您可以获得满足各种需求的数据。例如，普通配方对每个搜索图像执行一次自动对焦，然后获取搜索图像中所有孔的图像（图5B）。另一方面，Careful 配方会在所有检测到的孔附近执行自动对焦（图 5B）。此外，半自动配方可在用户指定的任何点执行自动对焦和图像采集（图 5B）。

图。 5

JADAS 概述。 (A) JADAS 图形用户界面。基本操作通过红框①中的五个按钮，按照红框②中的流程进行。红框③显示了当前使用动画需要做什么。各种导流板可在红框④中调节。 (B) 典型 JADAS 配方的概念图。蓝色部分为支撑膜，绿色部分为图像采集区域，红色部分为自动对焦区域。普通配方仅在搜索图像中执行一次自动对焦，并获取搜索图像中所有孔的图像。小心配方在搜索图像中检测到的所有孔附近执行自动对焦。半自动配方在用户指定的任何点执行自动对焦并获取图像。

Omega 滤波器和相位板

如上所述，使用cryo-TEM方法观察的样品由轻元素组成，因此主要观察相差。そのため通常の観察手段を用いると大変低い像kontorasutoしか得られない。除了欧米伽滤光片外，该装置还可以配备两个相位板的类型：Zernike型和无孔型，可以进行高对比度的冷冻TEM观察。
欧米伽滤光片是一种柱内能量滤光片，它使用狭缝切除分离光谱的能量损失光谱，使用零损失电子形成的图像成为噪声降低的高对比度图像（图6）。
另一方面，通过在物镜后焦平面安装相位板，将透射波的相位变化转换为强度信息，即使在正焦点处也可以获得高对比度图像（图7）。 Zernike和无孔相位板均由非晶碳薄膜制成，在使用前加热至约200℃。 Zernike 相位板的直径为 1μm的薄膜，大大提高了对比度，但在样品周围产生了特征条纹（图7B）[3]。在没有孔的相位板上，人们认为在相位板上形成的电子束的交叉会产生一个局部带电区域，这会改变穿过该区域的电子波的相位，从而产生与泽尼克相位板等效的效果。 [4]这个局部带电区域远小于Zernike相位板的孔径，可以减少上面提到的边缘现象（图7C）。

图。 6

使用 omega 滤镜获得的冰包埋脂质体的正常图像 (A) 和零损失图像 (B)。右下角的插图是红框内的放大图。采集设备为JEM-2200FS，各-2μm 的散焦度获得。狭缝宽度为20 eV，照射电子剂量约为20e-/Å2。

图。 7

使用相位板获得的冰包埋外泌体的零损失图像 (A)、Zernike 相差图像 (B) 和无孔相差图像 (C)。采集设备为JEM-2200FS，零损失图像为-2μm的散焦，并且在每个相位差的正焦点附近获取图像。狭缝宽度为20 eV，照射电子剂量约为20e-/Å2。样本由东京大学医学研究生院（国立癌症中心研究所，分子和细胞治疗研究部）的 Naomi Tominaga 友情提供。

结论

该装置已交付至大阪大学前沿生物科学研究生院质子纳米机器实验室，目前正在运行。它由 TFEG、高分辨率冷冻极片、冷冻台、CryoSPECPORTER™、omega 滤波器和 JADAS 组成。加藤等人。使用此设备β-半乳糖苷酶的单颗粒分析产生了高分辨率 33 Å 的结构分析结果 [5]。该结果是 200 kV 级 TEM 的最高水平（https://wwwebiacuk/pdbe/emdb/statistics_volt_sourcehtml/），但数据采集在约 15 小时的短时间内完成，数据分析在约 3 天的时间内完成。
在近年来取得显着发展的冷冻 TEM 领域，我们开发了一种新型冷冻 TEM (CRYO ARM™)，其具有多种功能，可实现更高的通量、可操作性和更高分辨率。该装置未来有望为包括结构生物学在内的各个领域做出贡献。

致谢

我们谨向 Takeshi Kaneko、Shuichi Yuasa、Kimitaka Hiyama、Naoki Fujimoto、Chiyode、Akito Kamoshita、Isamu Ishikawa、Yoshihiro Ozo 以及开发此设备的其他项目成员表示感谢。

参考文献

• Callway, E 革命不会具体化。自然, 525, 172-174（2015).
• Merk A、Bartesaghi A、Banerjee S、Falconieri V、Rao P、Davis MI、Pragani R、Boxer MB、Earl LA、Milne JL、Subramaniam S 打破冷冻电镜分辨率障碍，促进药物发现。细胞, 165, 1698-1707（2016).
• Hosogi N、Shigematsu H、Terashima H、Homma M、Nagayama K Zernike 相衬冷冻电子断层扫描技术对溶藻弧菌的钠驱动鞭毛钩基体进行分析。J。结构。生物., 173, 67-76 （2011).
• Malac M、Beleggia M、Kawasaki M、Li P、Egerton R F，通过无孔相位板方便地增强对比度。超声显微镜, 118, 77‒89（2012).
• Kato T、Hosogi N、Kaneko T、Ishikawa I、Namba K，最先进的 CryoEM 性能，名为“CRYO ARM™”。清武佛, 56，S121（2016）。