天游线路检测中心 采用固态NMR、X射线衍射和电子衍射相结合的低分子量有机物质的结构分析方法

简介

近年来，生物制药已在销售中占据主导地位，但很明显，小分子药物将继续在生活方式相关疾病和其他需要口服给药的疾病的日常治疗中发挥重要作用。许多低分子药物的活性药物成分（API）具有良好的结晶度，以含赋形剂的微晶粉末形式提供，例如片剂、颗粒剂和粉剂。由于这些药物的功效很大程度上受其晶型影响，因此从研发到质量控制的各个环节都需要原子级结构分析方法来区分晶体多晶型和盐/共晶问题，并且每天都会重复测量。特别是，为了鉴定晶型，粉末X射线衍射和固态NMR（核磁共振）测量以互补的方式被广泛使用。粉末X射线衍射法和¹³¹³C 在 CPMAS 中，赋形剂和 API 信号出现在不同位置，信号重叠问题并不严重，但晶型分辨率略逊于粉末 X 射线。这样，固态NMR和粉末X射线衍射的组合方法作为一种有效补充彼此不足的方法已广泛应用于药物研究。然而，这些方法并不通用，并且存在以下问题：1) 无法精确确定氢位置，2) 无法清楚地区分晶体形式，3) 取决于样品的通量低。
在这里，我们将重新审视复合方法，并考虑平衡吞吐量和信息内容的测量方法。首先，我想总结一下我们关注的每种方法的优点和问题。单晶 X 射线衍射是一种非常有用的技术，可以提供原子水平的结构信息。另一方面，10~100μm的非常大的单晶样品，使得无法以微晶形式分析含有API的制剂。另一个问题是氢的位置无法精确确定。尽管粉末 X 射线衍射对于识别晶型很有用，但它经常受到信号重叠的影响，这常常会导致药品分析出现问题。¹³C 虽然 CPMAS 固态 NMR 方法对峰位置的构象敏感，但它不能很好地反映堆积差异。另一个问题是整体结构无法直接确定。在本文中，我们引入电子衍射和¹我们建议使用1H固态NMR方法。电子衍射是透射电子显微镜（TEM）的测量模式之一，与单晶X射线衍射不同，它不需要非常大的晶体。其原因是电子表现出比 X 射线强 104 到 105 的相互作用，并且μm尺寸的极细单晶样品中也可以获得足够的衍射强度。幸运的是，配方中所含 API 的晶体尺寸足够大，可以通过单晶电子衍射来测量单晶衍射图样。虽然电子衍射具有巨大的潜力，但它存在电子对样品造成损伤的问题，在有机材料中的应用受到了限制。然而，随着近年来高灵敏度检测相机的发展以及低温支架造成的热损伤的减少，API 的电子衍射测量已经变得实用。¹H固态NMR方法弥补了一般衍射方法无法确定氢原子位置的问题。幸运的是，¹H核在稳定同位素核中具有最高的核旋磁比，与其他核表现出非常强的相互作用，并且结合超过99%的自然丰度比，表现出极强的信号强度。因此，原则上，它有潜力以高灵敏度测量许多核相互作用。另一方面，在固态核磁共振中，由于固体样品中强烈的核间相互作用，分辨率非常低。¹H 测量很少用于结构分析。然而，高速 MAS 技术的最新进展 [1-3] 使样本旋转速度比以前快了一个数量级，从 70 kHz 到 100 kHz。¹H 高分辨率核磁共振测量已经实现。
基于上述情况，本文提出了一种将X射线衍射、电子衍射和固态NMR方法有机结合的复合方法来解决晶体多晶型/盐/共晶问题。在接下来的章节中，我们首先讨论电子衍射和固态核磁共振在晶体多晶型物中的应用。我们还将介绍我们开发的一种新方法。接下来，我们将介绍 X 射线衍射和固态 NMR 的组合方法，为盐/共晶问题提供明确的解决方案，以及新开发的提高通量的方法。请注意，此方法并不是要取代传统方法，而是旨在通过以互补的方式使用它们来优化吞吐量和结果。

晶体多态性^[4]

药物的物理性质，如溶解度和稳定性，很大程度上受其晶型的影响，因此晶型的识别和控制是药物的一项重要技术。广泛应用的粉末X射线衍射和¹³C 如前所述，CPMAS 测量并不总是能清楚地区分晶体形式。例如，L-组氨酸盐酸盐一水合物和L-组氨酸¹³C CPMAS谱反映了构象差异，可以清楚地区分（图1），而L-组氨酸有两种不同的稳定晶型，斜方晶型和单斜晶型¹³C CPMAS 谱非常相似并且相互重叠且无法区分（图 1：b、c）。这是因为这两种晶型的分子构象几乎相同，晶型之间的差异源于分子间堆积的差异。因此，在本文中，作为这些传统方法的补充，我们将使用电子衍射和高速MAS。¹H 我们建议使用 NMR。

图1

(a) L-组氨酸盐酸盐一水合物，(b) L-组氨酸（斜方晶系），(c) L-组氨酸（单斜晶系）¹³C CPMAS 谱和构象。 （引自参考文献4）

图。图2显示了在室温下测量的L-组氨酸盐酸盐一水合物的TEM图像和电子衍射图。如前所述，通过电子衍射，配方中所含的子μm单晶的衍射图案。该样品在室温下的临界剂量仅为 10-20e-nm，这在常见的有机化合物中很常见。^-2，因此剂量率为 10 e-nm，以尽量减少电子损伤^-2s^-1和总剂量 10 e-nm^-2(= 01 e-Å^-2)。即使在如此低的电子辐射下，高灵敏度的 CMOS 相机（Gatan 的 OneView）也能提供非常清晰的衍射图案。由于可以轻松计算已知晶型的电子衍射图，因此可以清楚地识别L-组氨酸的两种不同的稳定晶型（图3、图4）。此外，测量时间不到1分钟，可以进行非常高吞吐量的测量。本次 TEM 测量使用了 JEOL JEM-ARM200F。

图2

(a) TEM 图像和 (b) 直径为 100 nm 的 L-组氨酸盐酸盐一水合物的纳米束衍射 (NBD) 图。 NBD照射到(a)中白色圆圈所示的区域。 （引自参考文献4）

图3

(a) L-组氨酸（斜方晶系）的实际电子衍射图。 (b) L-组氨酸（斜方晶系）的计算电子衍射图，(c) L-组氨酸（单斜晶系）的计算电子衍射图。 （引自参考文献4）

图4

(a) 测量的 L-组氨酸（单斜）的电子衍射图。 (b) L-组氨酸（斜方晶系）的计算电子衍射图，(c) L-组氨酸（单斜晶系）的计算电子衍射图。 （引自参考文献4）

另一方面¹³C 与 CPMAS 不同，它观察到分子表面存在许多氢核¹H NMR 对分子间堆积非常敏感。高速 MAS 使之成为可能¹H NMR的高分辨率谱图如图5所示。斜方晶系和单斜晶系几乎没有区别¹³C 与 CPMAS 测量不同，可以看出模式发生了明显变化。进一步¹H的自然丰度比超过99%，天然丰度比仅为11%¹³很容易与 C 不同¹H-¹可以测量H原子之间的相关性，并且可以更清楚地观察分子间堆积的差异。¹HDQ（双量子）/SQ（单量子）二维相关NMR如图6所示。由于两种晶型之间的分子间相互作用不同，可以看到清晰的图案。例如，在斜方晶系中，H1 和 H4 之间的距离为 41 Å，距离太远而无法给出相关性，而在单斜晶系中，H1 和 H4 之间的距离为 286 Å，并且观察到强相关信号。虽然距离差仅为 14 倍，但偶极子相互作用与距离的立方成正比，因此相互作用差为 29 倍，以存在或不存在相关峰的形式在 NMR 谱中给出了明显的差异。另外，¹HDQ/SQ二维相关测量可以在几分钟到几十分钟内完成，需要几个小时到一天的测量时间¹³C 值得注意的是，与 CPAMS 测量相比，可以通过更高的吞吐量获得结果。

图5

(a) L-组氨酸（斜方晶系），(b)（单斜晶系），L-组氨酸盐酸盐一水合物¹1H固态NMR谱。 （引自参考文献4）

图6

(a) L-组氨酸（斜方晶系），(b)（单斜晶系）¹H DQ/SQ 相关固态 NMR 谱。放大的叠加光谱如(c)所示（黑色：斜方晶系，红色：单斜晶系）。 （引自参考文献4）

¹H 通过 NMR 获得的更有趣的信息之一是氢位置的确定。 L-组氨酸的咪唑环中的氮可以变成NH，氢原子连接到τ和δ位置中的一个或两个。它也可以是两性离子。这些异构体之间的唯一区别是氢位置的差异，通过衍射很难区分它们。另一方面，利用NMR，通过直接观察氢原子核和氮原子核之间的相关性，可以轻松地区分它们。¹H/¹⁴N 二维相关NMR谱如图7所示。对于L-组氨酸盐酸盐一水合物，获得了三个NH相关信号。这表明存在三个 NH，即τ地点和δ这表明两个位置都是NH。另一方面，在所有光谱中¹⁴一个相关信号出现在N的低频处。这是NH₃⁺的存在，可见都是两性离子。像这样¹H/¹⁴N 二维相关测量是高通量测量，可以在几分钟到几十分钟内为异构体鉴定提供非常有用的信息。
对于上述固态NMR测量，使用JEOL RESONANCE制造的外径1mm的固态NMR样品管，并使用JNM-ECZ600R光谱仪。

图7

(a) L-组氨酸盐酸盐一水合物，(b) L-组氨酸（斜方晶系），(c) L-组氨酸（单斜晶系）¹H/¹⁴N相关固态NMR谱。 （引自参考文献4）

新开发的测量上述晶体多态性的方法

氮原子核有两种具有核自旋的同位素，¹⁴N 和¹⁵N 存在。氮占其自然丰度的 99% 以上¹⁴尽管有氮，但在几乎所有氮 NMR 测量中，天然丰度比仅为 04% 或更低¹⁵N被选择并且灵敏度低。这是¹⁴N的整数自旋和四极核的特征是¹⁴N 这是因为它使NMR测量变得困难。我们通过高速MAS¹H/¹⁴我们开发了一种测量 N-相关 NMR 的方法 [5]。通过这种方法，可以在短短几分钟内提取 1 mg 或更少的极少量样品。¹H/¹⁴我们成功测量了 N 相关二维 NMR 谱。另外，¹HDQ/¹⁴N/¹H SQ 也很容易扩展到三维 NMR 测量 [6]。此外，我们的方法是¹⁴它不仅可以应用于N，还可以应用于其他难以观察的原子核。盐酸盐，常见于小分子药物中。³⁵它也适用于 Cl NMR 测量 [7]。
分子结构和信号分配对于 NMR 信号解释至关重要。二维相关 NMR 提供两个核自旋之间的相关性，为信号分配提供重要信息，而三维 NMR 提供三个自旋之间的相关性，为链分配提供更清晰的信息。我们是¹³C/¹HDQ/¹使用小于1 mg的微量样品开发了H SQ三维相关NMR方法¹³C-¹H-¹H的三个自旋的相关信息，成功地将信号分配给L-组氨酸盐酸盐一水合物[8]。¹³C的自然丰度比仅为11%，但通过利用高速MAS提高的灵敏度，我们为低分子量有机物在自然丰度比下的清晰信号归因铺平了道路。

盐/共晶体^[9]

API晶体不一定表现出理想的特性（溶解度、稳定性等），人们已经进行了广泛的尝试，通过将它们与其他无害成分结合来改进它们。 API 通常是碱性的，可以通过接受酸性共形成物中的氢原子并形成分子间离子键形成盐来改善其物理性质。近年来，一种称为共晶的新形式的使用已变得广泛，这种新形式通常在 API 和共晶体之间的 pKa 差异小于 3 时获得（图 8）。此时，分子间的相互作用变成氢键和分子间力，不涉及氢原子的运动。此外，还报道了一种称为连续体的形式，它是盐和共晶体之间的中间体。这些形式的识别不仅对于药物开发而且对于保护知识产权都极其重要。另一方面，当pKa之差为3或更小时，可以采取任何形式，并且这些形式之间的唯一区别是氢原子的位置，因此难以通过X射线衍射来识别该形式。另一方面，如果我们从固态核磁共振的角度解释这些形式，我们可以提供一个明确的解决方案，即氢原子核和氮原子核之间的核间距差。在核磁共振中，已知原子核之间存在偶极相互作用，这种相互作用的大小与核间距离的立方成反比，与每个原子核的时间旋转比成正比。即，通过测量氢原子核和氮原子核之间偶极相互作用的大小，可以获得核间距离，并且可以清楚地区分盐、共晶体和连续体。

图8

(a) 共晶体、(b) 盐和 (c) 连续体的示意图。 （引自参考文献9）

这里，单晶X射线衍射和¹H 我们提出了一种复合方法来解决 NMR 中的盐/共晶问题。四种类型的样品被制备为 API/共形成剂模型（图 9）。首先，通过单晶 X 射线衍射确定了这些样品的整体结构。这种结构清楚地揭示了分子间相互作用的存在。然而，确定氢的位置并不容易，而且其值根据测量所使用的设备和分析软件的不同而有所不同，因此无法获得可靠的位置。因此，采用固态NMR方法¹H-¹⁵确定了 N 的核间距。从单晶X射线衍射获得的结构来看，氮核有助于原子相互作用¹H 和¹⁵N的核间距离，可以估计原子间相互作用的强度。例如，SA-2¹H-¹⁵N距离为125 Å，与粉末X射线衍射得到的分子间氮氧距离254 Å进行比较¹H位于氮和氧之间，被确定为连续体（图10）。虽然SA-2是由强酸和强碱组成的体系，pKa差值为3或更大，但一个非常有趣的结果是它不是盐而是连续体。这也强烈表明使用固态 NMR 确定氢位置的重要性，因为仅 pKa 的差异就可能导致错误的结果。以同样的方式，我们成功地确定了这四个样品的形貌（图10）。低¹⁵不幸的是，由于 N 的天然丰度和灵敏度，这种 NMR 测量的通量受到限制。尽管我们开发了如下所述的新测量方法来提高通量，但每个样品仍然需要大约 5 天的测量时间。尽管在吞吐量方面仍有很大的改进空间，但我们相信这是一个有价值的衡量标准，因为它使我们能够获得使用其他方法无法获得的信息。
对于该NMR测量，使用JEOL RESONANCE制造的外径1mm的固体NMR样品管，并使用JNM-ECA700II光谱仪。

图9

(a)SA1(3-硝基苯甲酸和N,N-二甲基吡啶-4-胺)，(b)SA2(3,5-二硝基苯甲酸和4-乙基吡啶)
(c) CO1（4-硝基苯甲酸和3-乙基吡啶）、(d) CNT1（五氯苯酚和4-甲基吡啶）的结构。 （引自参考文献9）

图10

SA1、SA2、CO1、CNT1的分子结构¹⁵N-¹高程距离测量。 （引自参考文献9）

盐/共晶（新开发的方法）

在此方法中，¹H-¹⁵我们开发了一种测量 N 核间距的新方法。¹⁵N 是一个小的旋磁比 (¹约H)的1/10，自然丰度比仅小于04%。因此，¹H-¹⁵N 仅产生很小的偶极相互作用，灵敏度非常低。作为一个更严重的问题，观察到¹H-¹⁵N-偶极子相互作用的大小常常受到实验条件的影响，因此很难以高可靠性准确测量它。因此，我们¹H-¹⁵我们开发了一种 inv CP-VC 方法来测量高速 MAS 下的 N 偶极子相互作用 [10]。虽然省略了细节，但是这个方法是¹⁵而不是测量 N 个原子核¹测量 H 原子核可显着提高灵敏度，并且只有满足适当实验条件的原子核才会产生信号 [11]，从而使高度可靠和精确的测量成为可能。此外，所需样品量小于1 mg，为痕量样品的测量铺平了道路。
在NMR测量中，自旋系统在测量前必须处于足够接近热平衡的状态。因此，在测量之前，纵向磁化弛豫时间（T₁)相同的订单等待时间。一般来说，低分子有机物质¹HT₁弛豫时间通常只有几秒钟，但药品是高度稳定的晶体¹HT₁放松时间通常为 100 秒甚至更长。此时，每次扫描的测量等待时间约为100秒，导致吞吐量极低。更严重的是，本次测量中测得的 NH 质子在物理上和光谱上与其他 1H 分离，因此比其他 1H 更长，尤其是在快速 MAS 下¹HT₁表示松弛时间。我们开发了一种方法来缓解吞吐量的下降，并将其应用于此测量[12]。 NH 质子在慢 MAS 下也很快 (< 20 kHz)¹H-¹H 自旋扩散的其他¹T 类似于 H₁表示松弛时间。然而，在快速 MAS 下¹H-¹由于H自旋扩散受到抑制，NH质子的弛豫时间变得更长。所以，在等待期间¹H-¹RFDR（射频驱动重耦合）方法被用来促进H自旋扩散。还有¹H-¹我们开发了一种新的相位旋转，可以最大限度地提高 H 自旋扩散的效率 [13, 14]。

结论（总结、结论）

¹H 使核磁共振变得实用。除了这些新获得的信息之外，我们不能忽视这样一个事实：这些技术实际上导致了吞吐量的提高。更重要的是，不是单独使用这些技术，通过适当地组合所获得的信息，可以有效地获得通过任何其他方法无法获得的重要信息。 天游线路检测中心推行的YOKOGUSHI战略就是基于这个想法，我希望本文能成为一个很好的例子。
在本文中，我们试图通过有机结合X射线衍射、电子衍射和固态NMR来解决小分子药物中存在的晶体多晶型和盐/共晶问题。 X射线衍射・¹³13C CPMAS NMR 组合广泛用于通过电子衍射鉴定配方中所含的晶型μ甚至可以从尺寸小于 100 m 的微晶中识别晶形，¹通过 H DQ/SQ NMR¹³C 表明可以鉴定通过CPMAS NMR无法区分的晶型。这只有通过更快的样本旋转才有可能¹H/¹⁴我们发现使用 N 相关 NMR 测量可以精确确定氢的位置。盐/共晶体的鉴定需要通过确定氢位置来了解分子间键合。尽管使用单晶X射线衍射很难精确确定氢的位置，但我们通过单晶X射线衍射和固态NMR确定了骨架结构。¹H-¹⁵N距离的精确测定表明可以清楚地区分盐/共晶/连续体。非常重要的是，研究表明，即使 pKa 差异超过 3 的组合也不会形成盐，而是形成连续体。

致谢

这项研究是与 RIKEN CLST-JEOL 协作中心的成员合作进行的，我们要向每位成员表示感谢，并感谢 天游线路检测中心 和 JEOL RESONANCE Ltd 的同事给予的大力支持。此外，许多成果是与 AMES 研究所、京都大学、东京农工大学、华威大学、IISc 班加罗尔、里尔大学、凡尔赛大学和密歇根大学合作研究的结果，我们对所有参与人员表示深深的感谢。

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