天游线路检测中心 NanoSuit® 方法可在高真空下观察活体和湿样品
JEOL 新闻第 47 卷第 4 期 张山隆彦滨松大学医学院医学院
简介
17世纪初，光学显微镜开始在整个欧洲使用。在1830年代，这导致了生命科学领域的范式转变，称为细胞理论，该理论指出“所有生物都是由细胞组成的”。后来，在20世纪中叶，开始开发使用电子束代替可见光的电子显微镜，并开始进行各种使用高分辨率的研究和技术开发。在生命科学领域，细胞器和病毒的发现极大地拓展了我们对生命的理解，导致细胞机制和疾病的阐明，导致许多范式转变。然而，电子显微镜的分辨率越高，就越需要有一个允许电子束通过的高真空环境，这会剥夺体内的气体和液体，使体积缩小，不仅使其体形而且其精细结构也会发生显着变形。因此，随着电子显微镜的发展，人们设计了许多用于观察的处理方法，以努力保持微观结构尽可能接近生命状态。这是一种观察化学固定标本的方法，使标本看起来尽可能接近活体。另一方面，基于尽可能观察原始样品的愿望，扫描电子显微镜（SEM）开发了低真空观察装置（低真空SEM和环境SEM）来抑制气体和液体的逸出，但很难完全防止液体蒸发。显然，如果我们能够在保持高分辨率的同时观察生物体的微观结构，我们就可以为生命科学研究做出贡献，但这条路已经被封闭了。这是因为人们坚信电子显微镜无法观察生物体。我们试图消除这种迷信。
高真空环境下是否有可能维持生命？
20世纪60年代，样品室的真空度为10-2Pa。这篇论文鼓舞了我们，因为它似乎表明了在电子显微镜下观察原始生命形式的可能性。高分辨率场发射SEM（FE-SEM，样品室真空度10）-3～ 10-5Pa) 为了便于任何人观察，作为研究的第一步，我们在 FE-SEM 下全面观察了各种生物体。不言而喻，当几乎所有生物被置于真空环境中时，它们都会脱气、脱水、被压碎并失去生命。图1(a)-(c))。然而，在一些最外层具有粘性细胞外物质（ECS）的生物体（许多双翅目昆虫的幼虫，包括黑腹果蝇）中，我们不仅可以观察没有体积收缩的微结构表面，而且我们还发现它们在FE-SEM内主动移动。该个体的形态在观察开始后一小时后也没有变化（图1（d））。 将样品放入 FE-SEM 中并立即用电子束照射（图2(a)) 当样品室抽真空后立即开始观察时，即使在观察开始一小时后，果蝇幼虫仍保持其形状并继续移动（图2（b，c））。然而，在相同的FE-SEM中，当我们将其暴露在没有电子束照射的高真空中并在电子束照射1小时后观察它时，我们发现它变得平坦并变形（图2（g））。换句话说，这意味着生物体暴露在电子束下对于在高真空环境中维持生命是必要的。当用透射电子显微镜（TEM）观察这些蛆虫的最外层时，在未暴露于电子束的蛆虫（图2（h））中未观察到的一层被新添加到暴露于电子束的蛆虫（图2（d））中，仔细观察发现它完全覆盖了整个蛆虫体。通过电子束聚合，ECS成为一种超薄的类似宇航服的材料，覆盖整个身体并连接到生命维持系统。当观察到的幼虫从电子显微镜中取出并继续饲养时，它们变成了表面上正常的成虫。我们使用超薄膜使用 NanoSuit 来支持生命®
[图1：各种生物体在场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）（a）至（c）中时会变形，但只有果蝇幼虫（d）在高真空环境中继续存活而不变形。 】
[图2]当用电子束照射的同时在SEM中观察果蝇时，观察到即使在观察开始1小时后，果蝇也在SEM内移动而不变形((a)至(c))。当在(f)中用光学显微镜确认移动的样品放置在同一SEM室中而不用电子束照射进行观察时，发现当用电子束照射1小时后观察时，样品已经变平。当用 TEM 观察时，活着并移动的样品有一个带有箭头的 NanoSuit。®形成了(d)，但在不进行电子束观察的情况下(h)则没有形成。 】
可以观察到所有昆虫 - 使用表面活性剂作为仿生理念
除了图1所示的生物之外，我们还把多种其他生物放入SEM中，但除了双翅目幼虫外，我们观察到的所有生物都无法在SEM内维持生命，并在几分钟内明显变形。如果果蝇幼虫的ECS可以通过形成膜来维持生命，那么通过分析这个ECS并制备物质是不是也可以维持生命呢？尽管进行了各种分析，但由于活体中发现的大分子多种多样，因此不可能鉴定出对生命维持重要的大分子。因此，通过在生物表面添加替代ECS的溶液并将其聚合，NanoSuit®我改变了主意，想知道是否可以创建一个。经过反复试验，我们选择了聚山梨酯20（Tween 20），它是一种基于ECS的材料，可以通过电子束/等离子体聚合成膜，也被指定为食品添加剂作为生物相容性材料。如果将毛茛直接暴露在等离子体中并用FE-SEM观察，它会因身体收缩而变形，并在几分钟内变平（图3（a）至（d））。但是，如果涂上一层非常薄的1％Tween 20水溶液，将其放在滤纸上，尽可能除去多余的溶液，进行等离子体处理，然后用FE-SEM观察，即使在高真空下也不会出现体积收缩（图3(f)-(i)) 可以在活着时观察到精细结构。蚊鱼在观察其细微结构的过程中也很活跃，观察结束后放回饲养水中，一周左右就长成了蚊子。对弓草裙截面进行 TEM 观察时，NanoSuit®的样品中，在最外层形成了50至100nm的薄膜，类似于果蝇幼虫的ECS（图3（j））。 NanoSuit for Tween 20 基于仿生思想的幼虫 ECS®可以形成，并且可以通过FE-SEM观察来观察活性状态的精细结构。使用仿生材料成功维持生命[2]、[3]。
[图3白纹伊蚊白纹伊蚊暴露于等离子体(a)并置于SEM中观察，插入后体积立即开始收缩(b)，30分钟后(c)开始出现箭头所示的电荷。当在高倍率下观察时，在箭头所示的区域中出现褶皱，并且在箭头(d)所示的区域中形成峰。另一方面，当涂上1% Tween 20溶液后，将溶液彻底擦拭干净，然后进行等离子处理，蝴蝶在SEM中仍然存活（并保持移动），即使在高倍率下观察，也能保持结构的规则性。当用 TEM 观察时，箭头所示的 NanoSuit®形成了(i)，但在未涂覆的样品(e)上没有观察到薄膜。 】
纳米套装®电子透明度
生物表面外的纳米服®覆盖时不一定均匀且平坦地分布 (图4(c)箭头))为什么可以观察到生命状态的超微结构（图4(b)）？将 1% Tween 20 水溶液浸泡在 NanoSuit 中®®覆盖微观结构，金颗粒存在于表面顶部（图4（f），箭头正下方的黑色层）。附着在生物表面的纳米服®不仅可以防止生物体内气体和液体成分的释放，而且有效透明，使得观察超精细结构成为可能。还表明，当表面覆盖有金时，可以进行低倍率观察，但无法再进行高倍率高分辨率观察。果蝇幼虫分泌的ECS、Tween 20等分子属于轻元素，密度较低，电子束容易穿过。我们相信这使得它可以在电子显微镜下充当透明服装。不管电子束多么容易通过，如果你使用像高浓度的50% Tween 20水溶液这样的东西，你最终会得到很厚的涂层，即使你可以在低倍率下观察整体外观，你也无法观察到精细的结构，所以你需要小心你使用的溶液的浓度[4]。此外，如果市售的SEM溶剂具有离子导电性，不仅不具有生物相容性，无法观察生物体，而且物质本身会发射二次电子和背散射电子，再加上溶剂的粘度，难以观察生物体的精细结构。 迄今为止进行的电镜预处理，最快需要一整天，最长需要几天。这是因为固定和脱水处理需要时间。然而，纳米套装®通过这种方法，可以在约3至5分钟的过程中对活体动物进行SEM观察。
[图4白纹伊蚊白纹伊蚊弓草裙表面的纳米套装®应用后，生命得以维持（a），并观察到超细结构（b）。然而，当用TEM观察时，它不一定均匀且平坦地扩散，并且如(c)中的箭头所示，它根据位置的不同而不均匀地扩散。那个纳米服®(d) 且表面微观结构变得无法观察到 (e)。当用TEM观察时，如(f)中的箭头所示观察到金属颗粒的聚集。 】
传统方法和NanoSuit®不同方法观察结果的比较
那些经过传统的固定、脱水和金属气相沉积方法处理的（图5(a) 至 (d)) 和 NanoSuit®进行的观察方法（图5（e）至（h）），可以看出存在显着差异。以叶甲虫为例 (塔利特斯跳跃者) 是一种甲壳类/片足类动物，喜欢潮湿的地方，生活在地中海地区的沙滩上。它是一种甲壳类/片足类动物，因其避免干燥或太湿的特殊行为而被广泛研究。[5]在常规观察中，每个身体部分都清晰分开（图5（a）），但使用NanoSuit®通过使用该方法，每个节点都变得光滑，没有凹凸不平的边缘。当以高放大倍数观察触角时，感觉毛的尖端（箭头）是分离的（参见图 5 (b) (f)、(c)、(g)），但使用 NanoSuit®在法则中，所有的点都排成一条直线，并且点聚集在一起。在触角的尖端也观察到很大的差异。虽然总有一个问题是哪个才是真正的形态，但有规律性，并且从生物体是有生命的背景来看，NanoSuit®我们相信利用该方法获得的观测结果更能反映生物的生存状况。
[图5滨甲虫T。跳跃者的常规方法(a)至(d)和纳米服®使用方法 (e) 到 (h) 进行比较。 】
纳米套装®基于开发的自立薄膜生产
可以维持生命的纳米服®通过将溶液暴露于高真空并用电子束或等离子体照射而形成。如果这种薄膜能够独立生产，将有助于许多工程应用。例如，在玻璃表面旋涂 Tween 20 等水溶液 (图6(a1))和等离子体照射工艺(图6(a2))表明可以形成各种薄膜。将薄膜朝上的玻璃基板缓慢浸入蒸馏水中，可以分离出自支撑薄膜（图6（a3）），并将该薄膜舀到带有窗口的塑料板上，可以研究自支撑薄膜的特性[6]。这种创建自支撑薄膜的方法可以很容易地从溶液中创建，将用于各种应用科学，包括工业应用。此外，这些自支撑薄膜可以由多种生物相容性材料制成[5]，作为医用片材具有巨大的潜力。
[图6(a)溶液成膜方法。 1) 溶液状态旋涂，2) 等离子体照射，3) 溶液中薄膜漂浮。 (b) 等离子处理玻璃基板上的薄膜。 (c) 蒸馏水中的独立式薄膜。 (d) 用塑料材料打开一个窗户，并将自支撑膜平贴在窗户上。 (d) 中的箭头表示独立薄膜的边缘。 】
结论
为了推进仿生学研究，需要尽可能观察活体节肢动物的表面结构，因此进行了“FE-SEM高分辨率/活体高分辨率观察”。由于仿生学研究的目的是将生物结构和功能应用于工程，因此参考结构必须尽可能反映生命本身。幸运的是，我首先将生物体随机放入电子显微镜中，并重点关注每个生物体的真空电阻。因此，NanoSuit®79199_79294 以Whittaker的五界理论为代表，生物有时被分为原核生物（monera）、原生生物、植物、真菌和动物界，但目前，几乎所有这些生物都被归类为NanoSuit®支持生命，现在可以在高真空电子显微镜中进行高分辨率观察。 这套纳米服®也可以有医疗应用。通过改进现有技术，现在可以利用仍湿润的固定组织（病理）标本进行分析和诊断，并可视化以前从未见过的组织、细胞和细胞之间的超微结构关系（论文正在准备中）。从患者身上取出的组织的超微结构只需几分钟即可观察到。我们相信，通过在手术室旁边安装电子显微镜，并在短短几分钟内进行活检直至超精细结构，帮助医生做出决策，我们将能够为全球范围内的健康管理做出贡献。作为医学院的成员，我们的地位非常好，可以说我们拥有完善的医学研究体系。 NanoSuit让你轻松观察超精细“生态”®可用于观察各种生物现象，也有望应用于农业等应用科学领域。例如，现在可以轻松地观察微小的花朵和昆虫等物体，而由于观察预处理造成的伪影，这是传统电子显微镜方法不可能实现的。这样，通过对生物体进行更多高倍率、高分辨率的观察，我们希望不断完善生物识别工具，为基础科学和应用科学领域的新范式转变做出贡献。 为此，纳米套装®除了自身的发展，我们还开发了电子显微镜，另一方面，NanoSuit®的工程用途仅适用于膜。 这项技术的开发完全是我们研究团队的原创想法，在世界上是独一无二的。目前，许多 NanoSuite®使用法律的追随者正在出现。我们还证实了“工业”公司研究机构追随者的出现。然而，为了开展这项研究，有必要开发一种使用各种生物相容性材料组合的纳米服。®、优化聚合和成膜、优化电子显微镜内的动态观察等需要大规模的研究团队和相关的预算。我希望看到“公共”和“工业”部门的全力支持，打破国内跟进海外研究的习惯，投资于世界上前所未有的研究。
致谢
这项研究是与 Yasuharu Takaku、Koji Suzuki、Isao Ota、Shogo Muranaka、Hidehiro Kawasaki、Satoshi Hirakawa、Takashi Tsutsui、Haruko Matsumoto、Sayuri Takehara、Daisuke Ishii 和 Masatsugu Shimomura 跨学科合作的结果。得到JST/CREST和新学术领域“基于生物多样性的创新材料技术（24120004）”的支持。我还要感谢北海道大学名誉教授下泽立雄教授对本研究的不断鼓励和支持。
参考文献
- RF皮斯，TL Hayes，AS，Camp 和 NM Amer。 “活体昆虫的电子显微镜。”科学 154, （1966） 1185-1186.
- YTakaku、HSuzuki、IOhta、DIshii、YMuranaka、MShimomura 和 THariyama。 “聚合物薄膜、纳米服，可以提高空气和高真空之间连续体的生存能力。”美国国家科学院院报，110，（2013）7631-7635。
- IOhta、YTakaku、HSuzuki、DIshii、YMuranaka、MShimomura 和 THariyama，“将生物体包裹在聚合物薄膜 NanoSuit 中，用于高真空 FE-SEM 观察。”显微镜 63, （2014） 295-300.
- YTakaku、HSuzuki、IOhta、TTtsui、HMatsumoto、MShimomura 和 THariyama。 ““NanoSuit”表面防护罩成功保护高真空中的生物体：在 FE-SEM 中对活体生物体的观察。”过程。 RSocB 282(2015) DOI：101098 /rspb。 20142857
- AUgolini、ACincinelli、TMartellini 和 SDoumett，“两种滨海沙蝉的盐浓度和太阳方向：塔利特斯盐塔（蒙塔古）和Talorchestia ugolinii Bellan Santini 和 Ruffo。” J 比较生理学 A, 201 （2015） 455-460
- HSuzuki、YTakaku、I Ohta、DIshii、YMuranaka、MShimomura 和 THariyama。 “仿生薄膜的原位制备及其对高真空生物体的表面屏蔽作用”
