天游线路检测中心 冻结并显示变化的分子结构。冷冻电子显微镜揭示生命的奥秘
采访 07
大阪大学前沿生物科学研究生院难波敬一教授
蛋白质构成了生物的身体，是思想和运动的基础。大阪大学难波敬一教授对其卓越的机制着迷，继续接受挑战，从其三维结构中解开其秘密。
从结构理解函数
人体内大约有100,000种蛋白质。它们各自发挥着各自的作用，例如构成身体组织的酶、负责新陈代谢的酶、在细胞膜上交换营养物质的酶、以及作为抗体攻击外敌的酶，这些都可以说是生命本身的活动。大阪大学前沿生物科学研究生院质子纳米机器实验室的难波敬一教授说：“可以说，蛋白质是在生物体内工作的纳米机器。我总是很好奇这些微型机器扮演什么角色以及它们如何运作。” 40多年来，他一直致力于从结构上阐明蛋白质功能的研究。蛋白质是由数百至数千个氨基酸组成的大分子。用作原料的氨基酸，除去一些特殊的氨基酸，只有20种。根据它们的组合方式，可以出现多达 100,000 种类型。当您想到连接在一起的数千个部件时，您可能会想象像链条一样的东西。诚然，蛋白质的相似之处在于它们都是由链组成，但与链的关键区别在于，每种蛋白质都有其独特的三维结构。它们由以复杂方式折叠的长氨基酸链组成，并且所有相同类型的蛋白质在完全相同的位置和相同的角度弯曲。然而，它的折叠方式有时会改变。有趣的是，即使是相同的分子结构，仅仅通过具有不同的三维结构就可以具有完全不同的性质。例如，疯牛病在2000年代初成为一个主要问题，并引起了食品和饮料行业的恐慌，人们认为它的起因不是病毒或药物，而是一种叫做朊病毒的蛋白质。令人惊讶的是，这种朊病毒实际上存在于人类和牛的大脑中。引起疯牛病的异常朊病毒仅具有部分不同的三维结构。换句话说，要了解蛋白质的功能，我们不仅需要使用分析设备了解其分子结构，还需要以某种方式观察其三维结构。
精密的生物分子马达
教授很早就关注生物分子的三维结构，并一直在继续他的研究。特别令人感兴趣的是一组称为分子马达的蛋白质。它之所以被赋予这个名字，是因为它旋转或直线移动，就像电机一样。在人体肌肉中，肌动蛋白和肌球蛋白等蛋白质结合形成肌原纤维，当它们沿直线移动时会引起肌肉收缩。看起来更像马达的可能是移动细菌细长的尾形鞭毛的分子马达。大肠杆菌和沙门氏菌有几条鞭毛，当它们移动时，它们将它们捆绑在一起，并像螺丝一样旋转以获得推进力。然而，它们的结构在很长一段时间内仍然未知。教授对这个谜团着迷，进行了反复研究以阐明其三维结构。正如“马达”这个名字所暗示的那样，鞭毛马达的结构与典型的电动机非常相似，由 30 种蛋白质制成的部件组成，例如环、轴承和转子。肌纤维由极其精确且高度重复的肌动蛋白和肌球蛋白纤维结构组成。据说电机是人类最伟大的发明之一，但事实证明这是一个令人发指的自负。为了作为发动机运行，必须从某处获取能量。人们知道鞭毛马达依赖于氢离子通过穿透细胞膜的定子通道的流动，而肌纤维依赖于肌动球蛋白的ATP水解，但仅凭这些并不能解释高能量效率。有人认为利用了热波动引起的布朗运动的能量，但其机制尚不清楚。热的来源是原子和分子波动的能量，如果将物体放大到原子水平，你会看到原子和分子以随机的方向和速度运动。由于热量引起分子和原子的随机运动，分子马达不应该能够产生一个方向的推进力。然而，它实际上是朝一个方向移动的。换句话说，似乎存在一种纠正随机移动的机制。最近，这位教授距离查明他的真实身份又近了一步。他们发现肌纤维中的肌动球蛋白具有棘轮状结构，使其易于在一个方向上脱离，而在另一个方向上难以脱离。这种巧妙的动力系统是由蛋白质分子改变其三维结构而产生的。
低温前沿
难波教授实验室安装的 JEOL 冷冻电子显微镜“CRYO ARM™”
这一发现之所以成为可能，是因为我们能够看到蛋白质的三维结构。长期以来一直成为此目的主流的方法称为 X 射线晶体结构分析。这包括使蛋白质结晶、将其暴露于 X 射线并测量其衍射反射的强度。这种方法从20世纪50年代就开始使用，90%的蛋白质三维结构都是用这种方法测定的。但是，它有一个重大弱点。这是结晶的前提。首先很难使其结晶。另外，结晶意味着将物质固定在最稳定的三维结构中。当分子马达发挥其功能时，其结构会发生重大变化，但只有稳定的形式才能结晶。换句话说，无法看到变化的三维结构。因此，冷冻电子显微镜正在引起人们的关注。这是一种配备有称为冷冻台的标本台的电子显微镜，可以在-160至-270摄氏度的极低温度下冷冻标本并进行观察。通过立即将每个蛋白质分子冷冻在液体乙烷中，将其捕获在冰中，从而产生“活”样品。通过使用冷冻电子显微镜从各个方向观察投影图像，可以获得蛋白质工作时结构的三维视图。由于只是冷冻，因此无需研究结晶条件。难波教授二十多年来一直专注于冷冻电子显微镜和开发分析方法。冷冻电子显微镜也被用来阐明肌纤维肌动球蛋白的运作机制。鞭毛马达的详细三维结构也变得更加清晰。这也是教授的夙愿。“像蛋白质这样小的东西的作用如何产生可见的肌肉运动？这正是我开始研究它的原因。我觉得我已经回答了大约一半的学生作业。”
立志成为世界第一的人
加藤助理教授（左）和难波教授在单独的房间操作冷冻电子显微镜
冷冻电子显微镜长期以来落后于 X 射线结构分析。其原因是决议不够充分。电子显微镜将强电子束照射到样品上，接收穿过样品的电子束，并利用阴影来描绘样品的形状。然而，由于生物分子的结构在暴露于强电子束时会被破坏，因此必须降低输出。这与如果你把一个微型灯泡照射到黑暗的房间里，你只能茫然地看东西是同样的逻辑。不过，这些挑战正在通过多年的技术发展得到克服。相机在硬件方面取得了长足的进步。 CCD 相机将电子束转换成光，然后接收它。在此过程中，噪声被放大，检测性能无法提高。然而，随着可以直接接收电子束的CMOS相机的出现，灵敏度和分辨率得到了提高，并且可以通过高速帧观察来校正图像模糊。这极大地提高了图像质量。在软件方面，图像处理软件的进步是显着的。研究人员从各个方向拍摄的数十万张蛋白质图像中寻找同一方向投影的图像，对齐位置和方向，并将其叠加，使图像更清晰。计算机处理速度的提高使得在实验室级别执行如此复杂的信息处理成为可能。
Namba教授实验室推出的CRYO ARM™是为了响应该教授“成为世界上最好的”的要求而开发的，其设计目标是实现超过20埃（1埃为01纳米）的结构分析结果。目的是实现超过标准 X 射线晶体学的分辨率。此外，现在可以自动设置和更换多个样本，提高了便利性。收集和分析图像所需的时间也显着减少，五六年前需要一年的分析现在可以在一周内完成。
突破即将到来
“在接下来的五年里，我们不仅能够看到蛋白质的三维结构，还能够看到所有生物分子复合物的三维结构，包括脂质和核酸，”教授满怀希望地说。特别是细胞表面膜蛋白的结构有望被分析用于实际应用。它是药物分子作用于机体的靶点，通过分析其结构可以阐明其作用机制。这将极大地改善治疗效果，并使创造无副作用的药物成为可能。未来，生物分子马达的工业应用可能会出现。这是一种非常节能的机器，不需要电源，使用环境热量作为主要能源运行。这将颠覆人类自有记录的历史以来就培育出的关于机器的常识。距离成为现实还有很长的路要走。然而，脚步声开始传入我的耳中。
β-半乳糖苷酶 26 Å 分辨率 CRYO ARM™
示例：含 PETG 的 β-半乳糖苷酶
显微镜：CRYO ARM™（肖特基 200 kV）/K2 峰会
图片数量：JADAS 3 天 2,500 次
图像像素大小：08 Å/像素
粒子图像数量：350,000（初始拾取），88,564（用于最终 3D 重建）
软件：Motioncor2、Gctf、Gautomatch、Relion20
总剂量：70 e-/Å2（70 帧（02 秒/帧 x 14 秒）
数据：由大阪大学 T Kato 博士和 K Namba 博士提供，2017 年 8 月
难波圭一
大阪大学前沿生物科学研究生院教授
大阪大学工学研究科博士课程毕业后，曾担任日本学术振兴会研究员、美国大学博士后研究员、新技术振兴机构（现日本科学技术振兴机构）组长，1992 年担任松下电器工业株式会社国际研究所研究主任。自 2002 年起担任现职。他的专业是分析分子马达等生物超分子的结构和功能。生物物理学。
发布时间：2017 年 9 月