天游线路检测中心 实现体内大分子三维结构分析的新方法

发布日期：2019/09/06

实现体内大分子三维结构分析的新方法
～现在可以分析生物膜中发挥功能的蛋白质的真实状态～
（产学界联合实际应用开发项目（NexTEP）的结果）

积分

• 传统的单颗粒分析方法需要提取目标分子，因此很难分析存在于生物膜内（真实环境中）的聚合物的结构。
• 我们实现了 IBSA（基于图像的结构分析）方法，可以在真实环境中进行结构分析。
• 这一进展使得分析生物膜内蛋白质的结构成为可能，预计将极大地有助于利用冷冻电子显微镜阐明生物功能和药物发现研究。

背景

单颗粒分析是冷冻电子显微镜的一种，不需要样品结晶，而这对于 X 射线晶体结构分析和核磁共振波谱分析至关重要^注2)。此外，由于只需极少量的水样即可实现原子级分辨率，因此确立了其作为结构分析方法的基础技术之一的地位。然而，该方法使用大量随机排列的目标分子图像。因此，需要将目标分子从细胞内部去除并纯化，从而无法捕获其在生物体中存在的状态。特别是，有时很难阐明存在于细胞膜中的蛋白质的功能，因为当使用表面活性剂将其从细胞膜上去除时，它们的分子结构会发生变化，因此对结构和功能之间关系的研究需要一种能够在它们存在于细胞膜中时在分子水平上阐明其三维结构的方法。
这个问题是通过东京医科齿科大学名誉教授 Yoshinori Fujiyoshi（开发时为名古屋大学的项目教授）开发的 IBSA（基于图像的结构分析）方法解决的。 IBSA方法是一种利用单粒子分析的优点，通过拍摄固定在冷冻状态的载物台上的样品的倾斜和非倾斜图像来提高三维重建的可靠性，并分析在生物膜内起作用的蛋白质的结构的方法。

开发详情

在此开发中，我们通过将具有自动样品传输和液氮供应机构的冷冻台集成到可从 天游线路检测中心 购买的原子分辨率电子显微镜中，完成了冷冻电子显微镜（图 1）。对于IBSA方法，我们构建并验证了算法，并检查了适合IBSA方法的样品制备条件。使用冷冻电子显微镜进行结构分析的结果，发现它是一种酶β−半乳糖苷酶^注3)对于 FSC（傅立叶壳相关）方法^注4)进行评估(FSC=0143) 导致分辨率为 027 nm。 （图2）

预期效果

使用冷冻电子显微镜进行结构分析与 X 射线结构分析的不同之处在于，样品不需要具有晶体结构，因此可以分析无法产生晶体的蛋白质的结构。此外，通过将IBSA方法应用于冷冻电子显微镜，可以分析在生物膜内实际发挥作用的蛋白质的结构，这有望极大地有助于阐明生物功能和药物发现研究。

参考图

图 1 冷冻电子显微镜

图2β−半乳糖苷酶三维重建结果

(A) FSC 图。红色虚线表示FSC=0143，分辨率定义为从与红色实线第一次相交的点算起的027 nm。
(B) 三维重建图和原子模型。
(C) 酶活性位点中的镁²⁺万古。

术语表

注1)单粒子分析法
这是一种使用电子显微镜观察大量分离的单个颗粒，并通过图像处理获得颗粒的详细结构的方法，无需X射线晶体结构分析所必需的样品结晶。

注2) 核磁共振波谱
将样品置于强磁场中，向核自旋排列的分子照射脉冲无线电波，引起核磁共振，然后根据分子恢复到原始稳定状态时产生的信号来分析分子结构的方法。

注3)β−半乳糖苷酶
一种源自大肠杆菌的蛋白质，其功能为四聚体，是一种将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖的酶。长期以来，人们利用X射线结构分析对其结构进行了分析。

注4) FSC（傅立叶壳相关）定律
分辨率估计方法之一。从电子显微照片中选择用于分析的颗粒被随机分为两组，并且每组的三维结构被独立重建。
对获得的独立三维结构进行傅里叶变换，并计算每个任意分辨率范围的两组之间的相关性。通常将相关值FSC首次达到0143的分辨率位置定义为分析结果的分辨率。