天游线路检测中心 纳米晶氢键可视化-有望促进小分子药物的开发和质量提升-

RIKEN科学技术中心协作总部指挥棒区研究促进计划RIKEN-JEOL 协作中心^[1]纳米晶分析协作组组长西山佑介（同步辐射科学研究中心核磁共振应用与利用组副组长、JEOL RESONANCE Co, Ltd技术部专家）、山崎俊雄、同步辐射科学研究中心下一代核磁共振设备开发组组长、米仓浩二生物力学研究组组长组、与京都大学 iCeMS、JEOL 有限公司等的联合研究小组^※开发了一种使用尺寸为 100 纳米（nm，1 nm 是十亿分之一米）至 1 微米（μm，1 μm 是百万分之一米）的微晶体来详细观察低分子有机化合物晶体结构（包括氢原子位置）的方法。

这项研究结果预计将有助于推动治疗生活方式相关疾病和花粉热的低分子药物的开发和提高质量。

晶体结构分析方法单晶X射线衍射^[2]需要10μm或更大的单晶，并且无法从制剂中所含的低分子活性成分的微晶（约01至1μm）进行结构分析。

这次的联合研究小组是电子衍射^[3]固态核磁共振（固态NMR）^[4]第一原理量子化学计算^[5]进行积分，我们开发了一种可以对01至1μm微晶进行精确结构分析的方法。利用该方法，甚至可以分析一般制剂中发现的掺假物的存在，并且可以分析以前未知结构的药物。西咪替丁^[6]的结构(晶型B)。

这项研究发表在英国在线科学杂志'自然通讯''（日本时间 8 月 6 日）。

图：西咪替丁晶型B的微晶阐明的原子级结构（左：红圈）

※联合研究组

• 科学技术中心协作总部指挥棒区研究促进计划RIKEN-JEOL协作中心
  纳米晶体分析协作单位
  队长西山佑介
  　（同步辐射科学研究中心NMR研究开发部NMR应用利用组副组长/JEOL RESONANCE株式会社技术部专家）
• 研究员（研究时）Candelaria Guzmán-Afonso
  访问研究员 You-lee Hong
  （京都大学iCeMS特别研究员）
  特别研究员（研究时）Henri Colaux
• 同步辐射科学研究中心
  NMR研发部NMR开发组
  下一代核磁共振设备开发团队
  团队负责人山崎俊雄
  利用技术开发研究部生物机制研究组
  集团董事 米仓浩二
  　（科学技术中心工业联合会总部指挥棒区研究促进计划RIKEN-JEOL合作中心下一代电子显微镜开发合作单位单位负责人）

• EM第一技术开发部第一组
  导演饭岛博文
• EM第一技术开发部第二组
  组长斋藤明宏
• 电镜应用系生物组二队
  福村琢磨
• EM应用部材料组二队
  导演青山芳孝
• EM第一技术开发部第一组
  组长 Sohei Motoki
• 日本电子亚洲私人有限公司有限公司
  高级产品经理及川哲夫

研究支持

这项研究得到日本学术振兴会 (JSPS) 科学研究补助金 B“利用电子束和 X 射线阐明离子动力供应器的操作机制（研究代表：米仓浩二）”的支持，同样具有挑战性的探索性研究“通过电子束晶体结构分析实现库仑电势的可视化（研究代表：米仓浩二）”，日本科学技术机构（JST）该项目得到了先进测量和分析技术和设备开发计划“高精度电子显微镜控制和生物聚合物晶体结构分析软件的开发（研究代表：Koji Yonekura）的支持。”

1。背景

可长期保存并口服的低分子药物用于治疗与生活方式相关的疾病和花粉热。为了保证小分子药物的稳定疗效，控制其活性成分的晶体结构非常重要。特别是，低分子有机化合物即使具有相同的化学式，也可以具有多种晶体结构（晶体多晶型）或溶剂化物结构（晶体假多晶型）。不同的晶体结构具有不同的溶解度、稳定性等，从而导致药效的变化。
通常，药品中的晶体结构是粉末X射线衍射^[2]确定或固态核磁共振（固态NMR）。然而，制剂中不仅含有活性成分，还含有淀粉、糖等。赋形剂^[7]，其X射线衍射图和NMR谱很复杂，活性成分和赋形剂的信号重叠。此外，如果配方中存在未知的晶体结构，则无法检测到其存在。
例如，在市售制剂中观察到用作镇痛剂的吲哚美辛和咖啡因的未知共晶。这种共晶体是通过将吲哚美辛和咖啡因以粉末形式一起研磨而产生的，但人们发现其溶解度与原始晶体不同，导致药效不同。将晶体一起研磨的过程经常用于药物制造过程中。由于这些原因，迫切需要直接确定药品中活性成分晶体结构的技术。
然而，广泛用作确定晶体结构的方法的单晶X射线衍射需要至少10微米（μm，1μm是百万分之一米）的单晶，而药物中含有的单晶尺寸在100纳米（nm，1nm是十亿分之一米）和1μm（01至1μm）之间。在某种程度上，不可能从微晶中直接确定低分子量有机化合物活性成分的晶体结构。此外，粉末X射线衍射作为微晶粉末样品的结构分析方法，需要由单一成分组成的粉末样品，并且不可能直接确定混合物制剂的结构。
另一方面，电子衍射中使用的电子束与物质之间的相互作用比X射线强约10,000至100,000至100,000倍，因此即使从约01至1μm的微晶体也可以获得足够的衍射图案。因此，最近，利用电子衍射进行小分子药物的结构分析已被报道并引起关注。然而，电子衍射经常将具有相似原子序数的原子混合在一起，例如碳、氮和氧，并且还存在无法清楚地看到氢的问题，而氢对于理解药物中的氢键很重要。

2。研究方法及结果

联合研究小组是透射电子显微镜^[8]通过使用第一原理量子化学计算的固态NMR和局部分析，我们开发了一种方法，可以准确地阐明约01至1μm的低分子量有机化合物微晶的晶体结构和氢键结构。
在此方法中，首先通过电子衍射研究粗略的晶体结构，但由于氢不可见，并且无法区分碳、氮和氧，因此提出了多种异构体作为结构候选物。因此，我们将利用第一原理量子化学计算来计算这些异构体的固态核磁共振谱。通过将计算出的 NMR 谱与实际的固态 NMR 谱进行比较，可以清楚地确定哪种异构体具有正确的结构。
作为具体实例，在结构已知的氨基酸L-组氨酸微晶的情况下，使用电子衍射进行结构分析。图 1)，可见分子结构中，碳、氮、氧原子的分配完全不同，氢原子的数量和位置是随机的。除了分子结构知识外，还根据固态NMR测量结果对结构进行了校正（图 2)，仍然有四种可能的结构。因此，通过比较计算的 NMR 谱和固态 NMR 谱，我们可以将其缩小到一种结构 (图3）。

图1 L-组氨酸的结构式和电子衍射获得的初始结构

黑色表示碳，蓝色表示氮，红色表示氧，白色表示氢。组氨酸的化学式是C₆H₉N₃O₂但是，如果你将其与结构式进行比较，你会发现每个原子的赋值完全不同。

图2 从固态NMR测量结果中筛选出的四种结构

侧链的咪唑基(5元环部分)被缩小为四种不同的异构体。

图3 真实和计算的NMR谱以及计算得到的能量的对比

条形图显示了实验获得的固态NMR谱与通过量子化学计算获得的NMR谱之间的均方偏差（左轴）。均方差越小，两个光谱越接近。紫色线图显示的是通过量子化学计算得到的晶格能量，能量越低越稳定（右轴）。 LH1 被确定为正确的结构，因为它是最稳定的并且与实验 NMR 谱最匹配。

使用此方法，西咪替丁晶型B^[6]的结构已确定。具体来说，他们通过使用电子衍射粗略确定其结构并从晶型B和晶型C的混合样品中收集具有相似晶体参数的晶体的电子衍射数据，成功地确定了晶型B的结构。
借助这项研究成果，我们利用固态核磁共振和第一性原理量子化学计算补偿了电子衍射带来的结构不确定性，最终推导出单一结构。此外，所获得的晶体结构揭示了复杂的分子内和分子间氢键，揭示了西咪替丁晶型B的稳定机制（图 4）。

图4西咪替丁晶型B的微晶电子显微镜图像及所得晶体结构

左边是西咪替丁晶型B的电子显微照片，右边是通过固态NMR、电子衍射和量子化学计算得到的左边红圈内的晶体结构。蓝色表示氮原子，黄色表示硫原子，灰色表示碳原子，白色表示氢原子。晶体结构通过氢键稳定，如橙色线所示。右下是右上结构的侧视图。

3。未来的期望

在这项研究成果中，我们通过第一原理量子化学计算将电子衍射和固态核磁共振有机结合起来，实现了对纳米级微晶的精确晶体结构分析，包括氢的位置。利用该方法分析均匀混合物的能力，有望应用于药品。由于小分子药物的精确晶体结构可以以片剂或粉末的形式确定，因此这可能有助于未来更稳定的质量保证。此外，预计迄今为止一直被忽视的未知晶型将会被发现，这将导致药品的改进。
此外，它不仅可以应用于药品，还可以应用于一般的微晶样品。例如，它被认为是有前途的多种结构和功能化学材料，如气体吸附、存储和离子导体，并且正在积极研究。多孔金属络合物(PCP/MOF)^[9]由于可以容易地获得高结晶度的PCP/MOC微晶样品，因此预计通过应用该方法将加速研究和开发。

4。论文信息

<标题>
通过电子和核磁共振纳米晶体学了解分子晶体的氢键结构

<作者姓名>
Candelaria Guzmán-Afonso†、You-lee Hong†、Henri Colaux、Hirofumi Iijima、Akihiro Saitow、Takuma Fukumura、Yoshitaka Aoyama、Souhei Motoki、Tetsuo Oikawa、Toshio Yamazaki、Koji Yonekura、Yusuke Nishiyama
†这些作者对这项工作做出了同样的贡献

＜杂志＞
自然通讯

＜DOI＞
101038/s41467-019-11469-2

5。补充说明

[1] RIKEN-JEOL 协作中心
RIKEN 和 天游线路检测中心 (JEOL) 共同建立的协作中心。成立于2014年11月，旨在创造分析和诊断设备领域的独特技术。
参考：2014 年 10 月 31 日主题“RIKEN CLST-JEOL 协作中心开业”
http://wwwrikenjp/pr/topics/2014/20141031_1/

[2]单晶X射线衍射、粉末X射线衍射
X射线衍射是通过用X射线照射晶体而获得的X射线散射图案（X射线衍射图像）来确定晶体内的原子排列（晶体结构）和电子分布（电子密度分布）的方法。当使用单晶作为样品时，称为单晶X射线衍射。当使用作为单晶集合体的粉末作为样品时，称为粉末X射线衍射。与粉末X射线衍射相比，单晶X射线衍射具有样品制备困难、测量耗时等缺点，但另一方面，它具有重叠衍射峰较少、衍射强度较强等优点。

[3]电子衍射
用电子束照射晶体并观察散射图案的方法。使用透射电子显微镜观察。 X 射线衍射提供电子密度分布，而电子衍射提供静电势。与 X 射线衍射和中子束衍射并列的衍射技术之一。与X射线和中子束相比，其特点是可以从极小的晶体中获得衍射图样。

[4]固体核磁共振（固体NMR）法
原子核具有核自旋，一些具有非零核自旋的氢和碳原子在置于强磁场中时会分裂成多种能态。当施加与该能量差相对应的电磁波时，发生共振现象并且电磁波被吸收。频率由原子核的类型和磁场的强度决定，但它也受到原子核周围电子状态的影响，因此它为周围电子的分布和原子的成键状态提供了线索。因此，NMR被用作确定分子结构的手段，并且由于可以从信号强度确定核自旋数，因此它也被用作定量测量的手段。与将待测物质溶解在溶剂中的溶液核磁共振相比，测量固态物质的核磁共振被称为固态核磁共振。尽管固体样品的NMR信号分辨率很低，但使用魔角样品旋转（MAS）方法可以提高分辨率和灵敏度，该方法通过将样品与磁场方向倾斜547度并高速旋转来测量样品。 NMR方法广泛用于测量固体样品。 NMR 代表核磁共振。

[5]第一性原理量子化学计算
一种仅使用量子力学理论而不依赖经验规则或实验数据来计算电子态的方法。通过计算给出最稳定能量的结构，可以优化结构并计算核磁共振从电子态观察到的参数。

[6]西咪替丁，西咪替丁晶型B
作为组胺 H2 受体拮抗剂而闻名。抑制胃酸的过度分泌。第一种采用合理药物设计方法开发的药物。已知其具有多种晶型，包括四种不同的晶型：A、B、C和D，以及M1、M2和M3的水合晶体。为了发挥药物的稳定功效，控制晶型极为重要。 C₁₀H₁₆N₆S表示。开发西咪替丁的詹姆斯·怀特·布莱克(James Wight Black)于1988年获得诺贝尔生理学或医学奖。然而，西咪替丁B晶型的结构长期以来不为人所知。这是因为晶型B是针状晶体，因此难以制备单晶X射线衍射所需尺寸的单晶。此外，由于晶型B经常以与晶型C的混合状态结晶，因此通过粉末X射线衍射进行分析也很困难。

[7] 辅料
一种无害添加剂，添加到片剂和粉末等剂型的药物中，用于稀释和成型，并方便处理。淀粉和糖被广泛使用。

[8] 透射电子显微镜
与将样品暴露在可见光下并进行观察的普通光学显微镜不同，在透射电子显微镜中，将电子束施加到样品上，并根据透射电子束的强度观察样品的形态。由于电子束的波长比可见光短得多，理论上可以达到01 nm左右的分辨率，用于生物分子及其复合物的结构分析。然而，电子与物质之间的强烈相互作用使得观察厚样品变得不可能。

[9]多孔金属配合物(PCP/MOF)
由称为连接基的多齿配体和金属离子组成的配位聚合物。许多材料表现出多孔性并具有有用的物理性质，例如气体吸附、气体分离和导电性。
PCP /MOF 代表多孔配位聚合物/金属有机框架。