天游线路检测中心 使用冷冻转移支架制备冷冻 TEM 样品
IB2021-04
简介
冷冻电子显微镜在分子生物学和生命科学领域引起了广泛关注。特别是，使用 TEM 进行观察是冷冻电子显微镜的典型方法，因此冷冻 FIB 越来越多地被用作样品制备方法。通过冷冻 FIB 制备的薄样品必须在冷冻状态下运输到 TEM。因此，我们尝试使用配备冷冻功能的 TEM 样品支架（冷冻转移支架），利用 FIB 进行样品处理并简单转移到 TEM。此测量使用酵母作为样品，并显示了冷冻转移的示例。 （图1）
图。 1 酵母的光学显微镜图像
图。 2 单光束加工观察装置JIB-4000PLUS
通过 Cryo-FIB 制备 TEM 样品
冷冻样品的TEM样品使用JEOL单光束处理和观察装置JIB-4000PLUS制备（图2）。JIB-4000PLUS 除了常规的散装样品电机平台之外，还可以配备侧入式测角仪平台 (SEG)。由于 TEM 支架可以直接插入 SEG，因此可以使用低温转移支架在冷却的同时进行 FIB 处理。作为冷冻转移支架，我们使用 Gatan 制造的 Elsa 支架（图 3）。该支架具有使用放置在杜瓦瓶中的液氮冷却支架尖端的样品部分的机构，并且通过将其插入附加的工作站中，可以在不暴露于大气的情况下运输样品。此外，由于在运输FIB处理后的样品时无需从支架上取下TEM样品网，因此可以重复FIB处理和TEM观察。
图3 冷冻转移支架
样品制备方法如下所示。 （图4）
- 分散在水中的酵母安装在TEM网格上，并通过将其浸入液体乙烷中来快速冷冻。 （图4-a）
- 将 TEM 网格固定在低温转移支架中，插入液氮气氛的工作站中，然后运输至 FIB。
- 使用FIB制备膜厚约150nm的薄样品。 （图4-b）样品制备过程的SIM观察图像如图5所示。
- 处理后的样品被运送至工作站并进行TEM观察。 （图4-c）
图。 4 样品制备方法示意图
图。 5 薄片处理过程SIM图
冷冻透射电镜观察
使用JEM-F200观察制备的薄片样品。图 6 显示了结果。除了细胞核、液泡和线粒体等细胞器外，我们还能够观察到液泡和嵴中的自噬体，即线粒体内膜结构。
图。 6 酵母的TEM观察图像
(a) 总体视图，(b) 液泡中的自噬体，(c) 线粒体中的嵴
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